應用LCQ 離子阱質譜儀和Mass Frontier 軟件分析藥物中間體的痕量雜質成分
前言
由于將一個新藥帶入市場的成本非常高，藥物公司能夠開發的藥物數量就會受到限制。為此，在藥物研發的早期，大多使用復雜的篩選技術來剔除那些沒有潛力的候選藥物。若要成功，必須對代謝物和雜質的吸收、分布、代謝、排泄和毒性（簡稱ADME/Tox）做出快速和準確的評估來表征先導化合物。雜質樣品的高通量分析對低濃度樣品，尤其是生物基質中的低濃度樣品提出了挑戰。各種可能的修飾作用使數據解釋進一步復雜化。Finnigan LCQ 系列離子阱質譜儀具有高靈敏度、高選擇性和復雜數據相關等操作性能，能很好的適應于藥物中雜質分析的需求。在組合化學研究中能夠快速采集、解析和分析結構數據，對化合物篩選工作的順利進行是至關重要的。Mass Frontier，是熱電用于解析和處理質譜圖數據的高級軟件包，配置該軟件包，能夠對所提供分子結構的碎裂途徑給出預測。在本文的研究中，使用了碎裂和機理模塊來確定一個先導藥物關鍵中間體的三個雜質的結構。
目標
對一個先導藥物的關鍵中間體的雜質的化學結構作結構鑒定。
實驗條件
用于分析的藥物樣品由Eisai 研究所提供。所有實驗在Finnigan LCQ 離子阱質譜儀上采用APCI 模式完成。使用Finnigan SurveyorTM 液相色譜儀和AQUASIL C18 （250×2 mm）色譜柱完成液相色譜分離分析。液相色譜條件：40％水和60％乙腈的流動相,等梯度洗脫，流速為300ul/ml，不分流（進入質譜）。
Finnigan LCQ 質譜儀的離子源參數如下：
電離模式: 正離子，APCI
加熱毛細管溫度：175°C
蒸發溫度：325°
CAPCI 電流：5μA
鞘氣壓力：80 個單位
輔助氣壓力：20 個單位
Mass Frontier 軟件提供了專為提高質譜圖解析速度而設計的高級分析工具包。作為八個模塊其中之一的碎裂和機理模塊，能夠根據用戶提供的化學結構自動預測碎片途徑和反應機理。基于模擬單分子離子離解反應的算法，碎裂和機理模塊包含了針對電子轟擊電離、質子化反應和化學電離等已知的反應機理。
碎裂和機理模塊的主要功能是：
● 核查所提供的化學結構與實驗得到的質譜圖之間的相關性
● 確認譜庫檢索給出的結果
● 識別在質譜圖中最相關化合物的結構差異
此外，碎裂和機理模塊可以模擬二級質譜實驗。當用戶輸入指定化合物結構，就會生成一系列理論碎片離子，與二級質譜實驗數據進行比較。在本研究中，對假設化學結構模擬產生的碎片離子與數據相關二級質譜實驗觀察到的子離子進行關聯分析，確認了先導藥物關鍵中間體中三個痕量雜質的結構。
討論
對一個先導藥物關鍵中間體的最近流程評價，Eisai 研究所認為在開始下一步工作前對這些中間體雜質結構的深入分析是必要的。由于產權原因，圖1 僅給出了這個化合物的部分結構。注射20μL（含100ng/μL 的藥物中間體和其雜質）樣品到色譜系統，洗脫分離
圖 1. 關鍵藥物中間體的部分結構圖
后進入質譜儀中檢測。LCQ 質譜儀采用了數據相關二級質譜掃描模式，在這個模式下，一次運行分析就可以采集到全掃描質譜和二級質譜數據，而不需要預先指定二級質譜的母離子質量數。
圖2a 給出了分析的總離子流圖。藥物中間體在質荷比m/z486處有很強的信號，對應保留時間是8.5 分鐘。另外觀察到背景離子（與樣品不相關）m/z 391，392 和393。從總離子流圖中扣除這些背景離子后，得到三個雜質m/z 分別為 538, 488 和556 的色譜圖（見圖2b）。根據質量數差異和同位素分布圖，推斷三個雜質為在藥物中間體的雙鍵上分別添加了ClOH，H2，和 Cl2（在圖1 中以紅色標記）。
圖 2.（a）保留時間在8.5分鐘的藥物中間體（m/z 486）的全掃描總離子流圖（b）扣除背景（m/z391, 392, and393）和藥物中間體（m/z486和487）后的低濃度雜質（m/z538, 488 和556）離子流圖