熒光素酶檢測設定
試劑盒中的試劑使用前需在室溫下孵育。向裝有2 . 2 m g 凍干底物的小瓶中加入220μL水混勻后即為螢火蟲酶底物。向裝有440μg凍干底物的小瓶中加入220μL水混勻后即為水蛭素腸桿菌素。用螢火蟲檢測緩沖液按1:50比例稀釋螢火蟲酶底物后即為螢火蟲工作液。用海腎熒光素酶緩沖液按1:50比例稀釋水蛭素腸桿菌素后即為海腎工作液。對一個96孔板來說，每種工作液(working solution)我們需要11mL，其中包含220μL各自的底物(substrate)。SoftMax? Pro Software中預配置的程序可以幫助執行實驗操作和結果分析，這需要以下的參數設置：
1、使用注射器1向孔中加入100μL螢火蟲工作液
2、等2秒鐘使反應充分
3、設置integration time 5秒檢測螢火蟲熒光
4、使用注射器2向孔中加入100μL海腎工作液
5、等2秒鐘使反應充分
6、設置integration time 5秒檢測海腎熒光
7、對每個實驗孔，需要將第一次測量(firefly熒光)與第二次測量(海腎熒光)的RLU值相比獲得數據。
SpectraMax iD5注射器模塊和SmartInject技術可以在加入試劑的過程中進行震蕩，從而保證試劑充分混勻以最大限度的獲得螢火蟲和海腎的熒光信號。
表2 在誘導與不誘導情況下不同轉染條件下獲得的比值。最好的條件是轉染試劑：DNA為2.5:1。
結果
相對于誘導條件的變化而言，各種轉染條件均能檢測到海腎熒光素酶的高表達，而加入細胞因子TNF-α會大大增加螢火蟲熒光素酶的表達水平(圖2)。總之，轉染試劑與DNA比例為2:1時熒光素酶的表達水平較其他比例而言最低。結果顯示誘導條件下，三種轉染比例條件下螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶均一化讀值較高(圖3)。然而均一化比值在3:1和2.5:1的轉染條件下較低，但是加TNF-
α誘導的與不加的倍比關系明顯較大。表2顯示三種轉染條件下誘導的倍比關系，最好的誘導倍比條件是試劑： DNA比例為2.5:1。
結論
在HEK293細胞系應用雙報告基因檢測法，我們證實了加入TNF-α強烈誘導NF-κB的表達。由于此系統對螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶都敏感，都可得到較強的信號。三種轉染條件下，我們加入TNF-α誘導使NF-κB均一化后的最佳比值可達到54倍。
使用SpectraMax? iD5 多功能微孔板讀板機、具有SmartInject? 技術的注射器系統，可用于檢測SpectraMax? DuoLuc?Reporter 實驗。預置的操作流程簡化了數據采集和分析的操作。SpectraMax Pro軟件可助你快速完整、靈敏可靠的獲得雙熒光素酶報告系統的檢測結果。
Reference
1. Oeckinghaus, A and Ghosh, S. The NF-κB Family of Transcription Factors and Its Regulation.
Cold Spring Harb Perspect Biol. 2009 Oct; 1(4): a000034.