應用Target MS2 方法對大鼠血漿中人重組干擾素進行絕對定量的測試
1. 前言
隨著蛋白質組學的不斷發展，蛋白質組學已廣泛深入到生物學研究的各個領域，目前，蛋白質組學研究已經由傳統的大規模鑒定逐步轉向了靶向蛋白質組學，研究內容已經由蛋白質鑒定擴展到了蛋白質相對和絕對定量，對復雜樣本中蛋白質的相對與絕對定量有助于發現疾病的生物標志物，對于研究各類疾病的發生與發展有著重要的意義。
基于質譜的蛋白質組學定量方法主要有SILAC，TMT，iTRAQ 以及應用三重四級桿的MRM 等，本文主要介紹了賽默飛世爾新一代臺式高分辨質譜儀Q-Exactive 在目標蛋白質定量方面的應用。結果顯示Q-Exactive不僅可以在ng級上樣量情況下達到98% 以上的蛋白質氨基酸序列匹配度，同時應用target ms2 方法，可以很好的對復雜樣本中目標蛋白質進行絕對定量，其定量下限達到了amol，動態范圍達到了6 個數量級，且線性相關系數在0.99 以上。
2. 實驗部分
2.1 樣品信息
人重組干擾素α-2b 標準品（濃度為1mg/ml），注射人重組干擾素α-2b 后的處理組大鼠血漿樣本以及空白大鼠血漿樣本。
2.2 實驗流程
1. 使用Full MS/ddMS2 方法對人重組干擾素α-2b 標準品酶解的肽段進行鑒定，篩選其unique peptide；
2. 將人重組干擾素α-2b 標準品酶解肽段稀釋成不同濃度的標準品，其濃度分別為104ng/ml，103ng/ml，102ng/ml，101ng/ml，100ng/ml，10-2ng/ml，并摻入至空白大鼠血漿樣本酶解肽段中，分別上樣18ul，使用Target MS2 方法根據其unique peptide 的fragment ion 峰面積，繪制標準曲線；
3. 處理組大鼠血漿酶解肽段上樣18ul， 根據其unique peptide 的fragment ion 峰面積計算出大鼠血漿中人重組干擾素α-2b 的濃度。
2.3 儀器條件
2.3.1 高效液相色譜條件
高效液相色譜儀：Thermo Scientific Easy-nLC 1000
色譜柱：C18 ,3μm, 100? ,75μm×15 cm
上樣量：均18 ul
流動相：A：0.1% Formic acid in water； B：0.1% Formic acid
in Acetonitrile
色譜梯度：
Time[mm:ss] | Duration[mm:ss] | Flow[nl/min] | Mixture[%B] |
00:00 | 00:00 | 350 | 3 |
05:00 | 05:00 | 350 | 8 |
42:00 | 37:00 | 350 | 20 |
47:00 | 05:00 | 350 | 30 |
50:00 | 03:00 | 350 | 90 |
60:00 | 10:00 | 350 | 90 |
2.3.2 質譜條件
標準品：
質譜儀：Thermo Scientific Q Exactive
噴霧電壓：2.6 kV
毛細管溫度：250 ℃
S-lens：50%
碰撞能量：27% HCD
分辨率設置：一級70,000@m/z 200，二級17,500@m/z 200
母離子掃描范圍：m/z 200-1800；子離子掃描范圍：startfrom m/z 100
Data-dependent MS/MS：Top 20
標準曲線與正式樣本：
質譜儀：Thermo Scientific Q Exactive
噴霧電壓：2.6 kV
毛細管溫度：250 ℃
S-lens：50%
碰撞能量：27% HCD
分辨率設置：35,000@m/z 200
Isolation Window：4 M/Z
Inclusion List：M/Z 451.75