應規范下呼吸道感染微生物檢驗的標本采集及報告方式

    病原學診斷是感染性疾病診斷的金標準，只有了解病原學和藥敏結果，才能真正做到選擇正確的抗菌藥物和合理用藥，同時避免細菌耐藥的發生。最終可節省醫療花費，減少住院時間，降低病死率[1]。而病原學診斷結果的正確與否，關鍵在于標本管理，直接影響治療策略及療效、實驗室成本和效率。因此，臨床醫護人員應知曉微生物室對標本采集和運送要求，實驗室也應滿足醫生的需求，提供準確、有臨床意義的結果[2]。

    目前，國內臨床微生物室每日接收最多的標本是痰細菌培養，可占日工作量的一半甚至更多。然而，痰標本并不是診斷細菌性肺炎的最佳標本，痰標本在某種程度上都有口咽部正常菌群的污染[3,4]，而血培養、支氣管肺泡灌洗液(BAL)則更能提供可信的病原菌信息，但由于BAL標本的采集需侵入性操作，有些患者不適合或依從性差，最方便易取的還是痰標本。下呼吸道標本的采集和送檢要求都不盡相同，標本質量對后續檢驗質量影響非常大。如果說對"垃圾"標本做檢驗，得出的一定是"垃圾"結果[2]。因此，臨床了解實驗室如何規范下呼吸道細菌感染標本的質量及選擇報告結果非常重要。

一、下呼吸道感染做細菌學檢驗的標本及項目[5]

1．纖維支氣管鏡采集的標本：

    經纖維支氣管鏡獲取的BAL和保護毛刷標本(PSB)適合做細菌定量培養，當潛在致病菌的菌落數大于閾值時，其診斷下呼吸道感染的特異度可達82%～91%，診斷價值遠高于痰標本。對于機械通氣相關肺炎、免疫低下患者肺炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、ICU病房重癥患者、經抗菌藥物治療未獲改善者、艾滋病患者、痰檢陰性、疑似肺結核或支氣管結核者等情況下，醫生選擇采集送檢。

    BAL適用于檢測條件致病菌引起的肺部感染的所有試驗，推薦做定量細菌培養、分枝桿菌和真菌培養、抗酸染色和革蘭染色、直接熒光抗體法檢測病毒、肺孢子菌等檢測。PSB標本只用于診斷細菌性肺炎，推薦做定量細菌培養和革蘭染色。

    支氣管灌洗液(BS)來自主氣道，含上呼吸道污染菌，更適合診斷由嚴格致病菌引起的肺炎，如結核分枝桿菌、軍團菌屬、內源性真菌，推薦送檢分枝桿菌培養、真菌培養，革蘭染色、抗酸染色，直接熒光抗體法檢測軍團菌和肺孢子菌。

2．誘導痰標本：

   適于檢測卡氏肺孢子菌和結核分枝桿菌，對其他病原菌檢出效果差，不用于細菌培養。

二、標本留取和運送的要求

1．纖維支氣管鏡標本的采集要求：

    纖維支氣管鏡可采集到感染部位的標本，包括BAL、BS、PSB及支氣管穿刺活檢標本，均應由呼吸科醫師或經培訓醫師采集；為防止污染，應采用吸入麻醉劑，勿從支氣管鏡的工作腔中吸取灌洗液標本；標本采集順序為：BS、BAL、PSB和活檢標本，應避免帶血。

2．痰、氣管吸出物標本的留取：

    當有下呼吸道細菌感染指征時，患者在醫護人員的指導下先用無菌生理鹽水漱口，可減少口腔污染菌的數量，如有假牙應先摘掉；咳出清晨第一口深部痰，留至帶螺旋蓋的防漏無菌痰杯內[6]。僅當插管患者出現肺炎癥狀時(如發熱或浸潤)采集氣管吸出物，因氣管在插管24 h后即有定植菌，在無肺部感染癥狀時吸痰送檢，培養結果往往與疾病不符[7]。嬰幼兒和小齡兒童可吸取氣管和支氣管的分泌物，常用于診斷細菌性肺炎[2]。

3．標本的運送要求[7]：

    臨床采集的標本均應盡快送至實驗室，實驗室對來自急診、新入院患者和有創方法采集的標本(如：BAL和肺活檢標本)要盡快處理，以保證致病菌的活性，避免造成重復采集標本。通常做細菌學檢驗的標本應在2 h內(室溫)送至微生物實驗室。延誤送檢將導致口咽部定植菌過度生長，有臨床意義的病原菌數量減少。如需遠程運送，建議將標本放置2～8 ℃環境(不超過24 h)，但培養分離到肺炎鏈球菌等苛養菌的機會和數量將會減少。實驗室應在報告中對標本延遲送檢或經低溫冷藏予以說明，并指出可能對培養結果造成的影響。

4．拒收的標本[7]：

    實驗室接收標本后，首先篩選并拒收以下不合格標本：24 h內重復采集的痰培養標本、唾液、鼻沖洗液和分泌物、鼻孔拭子、咽部標本、未經保護套管收集的支氣管刷培養標本及痰的厭氧菌培養標本。除支氣管穿刺吸出物、PSB、活檢標本、胸水或其他未經污染的標本外，其余類型的標本均不適合做厭氧菌培養。

5．涂片革蘭染色判斷標本的合格性[5]：

    肺部感染的最常見機制是肺泡內吸入了口咽部定植菌，培養方法的局限性在于敏感性低，且無法判斷分離菌是感染或定植。因此，實驗室需借助涂片革蘭染色方法評估痰標本的質量。此外，涂片還可提高下呼吸道感染病原學診斷的特異性和敏感性，并發現培養不能生長的細菌，是既快速又低成本的方法，但需要實驗室人員的豐富經驗。

    通常標本中上皮細胞的數量代表污染程度，白細胞內或外的優勢菌(非黏附在鱗狀上皮細胞上)有助于預測肺部致病菌。可接受做培養的痰、支氣管吸出物標本包括涂片革蘭染色所見：(1)<10個鱗狀上皮細胞(SEC)/低倍視野(LPF)，大量多形核白細胞(WBC>25個/LPF)，且存在肺泡巨噬細胞和柱狀上皮細胞均提示來自深部痰標本；(2)WBC>25個/LPF，SEC<25個/LPF;(3)WBC∶SEC>10∶1，單一形態的細菌量達到3＋～4＋。不適合做培養的判斷：當SEC>10個/LPF，提示標本被唾液污染；還包括當吸痰涂片未見細菌時[5]。

6．涂片可提示與感染相關的信息[7]：

    通過涂片革蘭染色，實驗室應報告臨床提示感染的信息，雖然由兩種致病菌同時引起的感染不常見，但當兩種形態的細菌均與白細胞相關時要報告；即使涂片未見細菌時仍有助于評價患者狀況，可能隱藏著某些特殊菌，如軍團菌、內源性真菌、結核分枝桿菌或其他可引起非典型肺炎的致病菌；質量合格的標本中，涂片有正常菌群及多種細菌(通常白細胞內有空泡或液泡)，特別當培養生長正常菌群時，報告要提示有吸入性肺炎等。

三、對培養結果的報告[7]

    陽性培養結果包括對致病菌和可疑感染的定植菌的報告，致病菌一旦分離到就應報告，對定植菌一定要根據涂片找到感染的證據才報告。

1．報告下呼吸道致病菌：

    培養分離到化膿鏈球菌、B群β–溶血鏈球菌(兒童)、博德特菌屬(特別是支氣管博德特菌)、奴卡菌屬、新生隱球菌，高致病菌包括：弗朗西斯土拉菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽芽孢桿菌、絲狀真菌(排除腐生菌污染)，均作為下呼吸道致病菌報告。

2．報告可疑定植菌感染：

    對于口咽部的定植菌引起下呼吸道感染的判斷，需要培養結果和涂片可見該細菌和炎癥細胞相關時才報告：(1)例如肺炎鏈球菌含藥敏結果，流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌和腦膜炎奈瑟菌含β–內酰胺酶結果；(2)只對住院患者報告銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、鮑曼不動桿菌、洋蔥伯克霍德菌，并報告藥敏結果；(3)對金黃色葡萄球菌，B群β–溶血鏈球菌(成人)、C群或G群β–溶血鏈球菌，單一形態革蘭陰性桿菌(特別是肺炎克雷伯菌)，脲酶陽性的棒狀桿菌或分離來自ICU的患者的棒狀桿菌，分離自免疫抑制患者的馬紅球菌，當呈優勢菌生長時才報告。

    BAL和PSB經定量培養，菌落計數分別≥104 CFU/ml和≥103 CFU/ml時具有臨床意義，鑒定并報告該細菌和藥敏結果[7,8]。
免疫抑制患者是特殊人群，對于免疫正常患者不致病的定植菌，如念珠菌是口腔定植菌，不會引起肺炎，但對腫瘤患者(如：白血病)、肺移植患者或新生兒有意義。

3．對非致病菌的報告：

    當僅培養到2種以上的革蘭陰性桿菌，實驗室只需初步鑒定和報告"腸桿菌科細菌"或"非發酵革蘭陰性桿菌"，并不代表有臨床意義，應該是定植菌。

    實驗室對分離到的草綠色鏈球菌和(或)非致病奈瑟菌、類白喉菌、凝固酶陰性葡萄球菌、羅斯菌屬、F群鏈球菌、厭氧菌、嗜血桿菌屬(非流感嗜血桿菌)、艾肯菌屬、放線桿菌屬、嗜二氧化碳菌、莫拉菌屬、腸球菌屬、酵母樣真菌，未達到有意義數量的金黃色葡萄球菌、革蘭陰性桿菌及腦膜炎奈瑟菌，均報告"分離到口咽部正常菌群" [7]。

    由于選擇的培養方法不支持病原菌生長、抗菌藥物影響、標本送檢時間延長、口腔正常菌群污染等可導致假陰性結果出現；而污染菌對標本檢測結果的影響以及過度解讀細菌學結果等可導致假陽性報告。

四、實驗室與臨床的溝通和配合

    為了保證分析前標本采集的質量，建議當醫師向患者交代醫囑不到位時，護士能有效補充；患者留取咳痰標本時要有醫護人員在場監督[9]。如果實驗室檢測無臨床價值的標本，必將誤導臨床治療，同時也耗費實驗室過多的寶貴資源，實驗室應拒絕培養不合格的痰標本，并通知臨床重新采集標本送檢[2]；應提供給臨床最新版標本采集手冊，并定期去臨床各科室進行標本采集和運送的培訓。然而，現狀是不合格標本送檢率高，很多實驗室不敢拒收，擔心臨床不再送標本，這是臨床和實驗室溝通不暢的表現，且嚴重影響了實驗室的檢驗質量。
以上主要內容已編入2013年立項的衛生行業標準《下呼吸道感染細菌培養操作規范》，并已通過國家衛生計生委員會臨床檢驗標準化委員會的批準，將在近期出版，以規范微生物實驗室的操作。實驗室應依據相關指南進行操作和報告，在必要時與臨床積極溝通；對于實驗室報告的結果，臨床還需結合患者的病情分析是否予以采納。終歸正確的微生物檢驗報告是始于合格的標本。

參考文獻
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