1. 印跡膜制備 按常規方法完成SDS-PAGE和電轉膜操作,適當的封閉非常重要。可以通過標記一抗或二抗的手段引入HRP,一般采用市售的HRP二抗交聯物。仔細地淋洗對于降低背景非常重要,在與HRP交聯物溫育后,膜片更需仔細洗滌,所有步驟均在室溫下完成。
2. 化學發光試劑的配置 在使用前等量混合a液和b液,混合后盡快使用。將膜片置混合液中于室溫下振蕩溫育2分鐘,每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片。
3.蛋白信號顯現
1). 用平頭鑷鉗住膜片,垂直置于吸水紙以吸去過量試劑。
2). 置膜片于二層保鮮膜之間,小心趕盡氣泡。
3). 將膜片吸附蛋白面朝上,置于x光片盒中。
4). 于暗室中壓上x光片。
5).根據信號的強弱適當調整曝光時間,一般為1min或5min,也可選擇不同時間多次壓片,以達最佳效果。顯影沖洗。
6). 調節曝光時間,再次曝光顯影。
4、膜的重復使用:
配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巰基乙醇的溶液,膜放入后,70?c振蕩水浴30分鐘。再用tbst或pbst緩沖液洗脫,最后用bsa(牛血清白蛋白)或牛奶封閉。