底物濃度對催化反應速度的影響及米氏常數Km 和最大 反應速度Vmax的測定實驗
實驗方法原理
根據Michaelis-Menten 方程:
可以得到Lineweaver-Burk 雙倒數值線方程:
在 1/ V 縱軸上的截距是1/ Vma x , 在1/ [ S ] 橫軸上的截距是- 1/ Km 。
測定Km 和Vmax , 特別是測定Km , 是酶學研究的基本內容之一, Km 是酶的一個基本的特性常數, 它包含著酶與底物結合和解離的性質, 特別是同一種酶能夠作用于幾種不同的底物時,米氏常數Km 往往可以反映出酶與各種底物的親和力強弱, Km值越大, 說明酶與底物的親和力越弱, 反之, Km 值越小, 酶與底物的親和力越強。
雙倒數作圖法應用最廣泛, 其優點是: ① 可以精確地測定Km 和Vma x ; ② 根據是否偏離線性很容易看出反應是否違反Michaelis-Menten 動力學; ③ 可以較容易地分析各種抑制劑的影響。此作法的缺點是實驗點不均勻, V 小時誤差很大。
建議采用一種新的Eisenthal 直線作圖法, 即將Michaelis-Menten 方程改變為:
作 圖時, 在縱軸和橫軸上截取每對實驗值: V1 ～ [ S ] 1 ;V2 ～ [ S ]2 ; V3 ～ [ S] 3 ; ———連接諸二截點, 得多條直線相交于一點, 由此點即可得Km 和Vmax 。
此作圖法的優點是: ① 不用作雙倒數計算; ② 很容易識別出那些不正確的測定結果。
還可以用Hanes 方程進行作圖, 斜率是1/ Vma x , 截距分別是- Km 和Km/ Vma x :
實驗材料 蔗糖
試劑、試劑盒 乙酸緩沖液葡萄糖果糖蔗糖二硝基水楊酸溶液
儀器、耗材 分光光度計水浴鍋試管保鮮膜
實驗步驟
1. 本實驗和下一個實驗均采用二硝基水楊酸法測量反應產物還原糖, 為了掌握該法測定的范圍, 可先作一條標準曲線。按下面的“ 表1” 進行實驗操作:
用第1 管作空白對照, 測定其余各管520 nm 的吸光度A520 。用A520 值對還原糖的μmole 數作圖。
2. 按下面的“表2”測定不同底物濃度對催化速度的影響。
為使Km 測準, 必須先加蔗糖, 精確移液, 準確計時, 每隔30 秒鐘或1 分鐘加酶一次, 加酶后要搖動一下試管,每支試管
都要保證準確反應5 min , 然后加1.0 ml 二硝基水楊酸試劑, 立即用保鮮膜蓋住管口, 繞上橡皮筋, 用針刺一小孔, 幾根試管用一根橡皮筋套住放入沸水浴, 煮5 min 后取出放入冷水中速冷。最后加3.0 ml H2O, 充分搖勻, 必要時可用一小塊保鮮膜蓋住管口, 反復倒轉試管, 混勻。用比色杯測定時, 空白對照管溶液必須充分搖勻, 徹底除去氣泡, 測A520 值時要檢查參比杯內壁上是否有氣泡, 若有, 須倒回原試管, 再搖動除去殘余氣泡。實驗中不允許用嘴吸試劑。實驗完畢后要注意洗手。
3. 第9、10 二管先加中止反應的NaOH 溶液, 后加酶, 以保證加酶后不再產生任何還原糖, 用以校正蔗糖試劑本身的水解和酸水解。用第9、第10 二管的數據畫一直線, 求出其他各管的校正數據, 對所測各管的A520 值進行校正, 然后計算每管的[ S ] , 1/ [ S] , V 和1/ V。
4. 畫出反應速度V 與底物濃度[ S ] 的關系圖(米氏曲線)和1/ V-1/ [ S ] 雙倒數關系圖(不要直接用A520 值作圖) , 計算
Km 和Vmax , 并與文獻值進行比較。實驗結果記錄時, 要將[ S ] 和V 的單位表示清楚, 并列出反應速度的計算公式。