實驗原理
酶促反應速度與底物濃度的關系可用米氏方程來表示：
式中，v──反應初速度（微摩爾濃度變化/min）；
V──最大反應速度（微摩爾濃度變化/min）；
［S］──底物濃度（mol/L）；
Km──米氏常數（mol/L）。
這個方程表明當已知Km及V時，酶反應速度與底物濃度之間的定量關系。Km值等于酶促反應速度達到最大反應速度一半時所對應的底物濃度，是酶的特征常數之一。不同的酶Km值不同，同一種酶與不同底物反應Km值也不同，Km值可近似的反應酶與底物的親和力大小：Km值大，表明親和力小；Km值小，表明親合力大。測Km值是酶學研究的一個重要方法。大多數純酶的Km值在0.01～100mmol/L。
Linewaeaver―Burk作圖法（雙倒數作圖法）是用實驗方法測Km值的最常用的簡便方法：
于是實驗時可選擇不同的［S］，測對應的v；
本實驗以胰蛋白酶消化酪蛋白為例，采用Linewaeaver―Burk雙倒數作圖法測定Km值。胰蛋白酶催化蛋白質中堿性氨基酸（L-精氨酸和L-賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵水解。水解時有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判斷自由氨基增加的數量而跟蹤反應，求得初速度。
試劑和器材
一、試劑
10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）：分別取10、20、30、40g酪蛋白溶于約900mL水中，加 20mL 1N NaOH連續振蕩，微熱直至溶解，以1N HCl 或 1N NaOH調pH至8.5，定容至1L，即生成四種不同［S］的酪蛋白標準溶液。
中性甲醛溶液：75mL分析純甲醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液，以0.1M NaOH滴至微紅，密閉于玻璃瓶中。
0.25%酚酞加50%乙醇溶液：2.5g酚酞以50%乙醇溶解，定容至1L。
標準0.1M NaOH溶液。
二、材料
胰蛋白酶溶液：稱取2g胰蛋白酶溶于50mL蒸餾水中，放入冰箱保存。
三、器材
50mL三角燒瓶（×16），150mL三角燒瓶（×4）；吸管5mL（×1），10mL（×5）；量筒 100mL（×4）；25mL堿式滴定管及滴定臺，蝴蝶夾；恒溫水浴；滴管。
操作方法
1．取50mL三角瓶4個，加入5mL甲醛與1滴酚酞，以0.1M標準NaOH滴定至微紅色，4個瓶顏色應當一致，編號。
2．量取40g/L酪蛋白50mL，加入一150mL三角瓶，37℃保溫10分鐘，同時胰蛋白酶液也在37℃保溫
10分鐘，然后吸取5mL酶液加到酪蛋白液中。（同時計時！）充分混合后立即取出10mL反應液（定為0時樣品）加入一含甲醛的小三角瓶中（1號）加10
滴酚酞；以0.1M
NaOH滴定至微弱而持續的微紅色。在接近終點時，按耗去的NaOHmL數，每mL加一滴酚酞，再繼續滴至終點，記下耗去的0.1M標準NaOH
mL數。
3．在2分鐘、4分鐘、6分鐘時，分別取出10mL反應液，加入2號、3號、4號小三角瓶，同上操作，記下耗去 NaOH mL數。
以滴定度（即耗去的NaOH mL數）對時間作圖，得一直線，其斜率即初速度為V40（相對于40g/L的酪蛋白濃度）。
然后分別量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶液，重復上述操作，分別測出V30、V20、V10。
利用上述結果，以1/v對1/[s]作圖，即求出V與Km值。
注意事項
（1）實驗表明，反應速度只在最初一段時間內保持恒定，隨著反應時間的延長，酶促反應速度逐漸下降。原因有多種，如底物濃度降低，產物濃度增加而對酶產生抑制作用并加速逆反應的進行，酶在一定pH及溫度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反應的初速度為準。
（2）本實驗是一個定量測定方法，為獲得準確的實驗結果，應盡量減少實驗操作中帶來的誤差。因此配制各種底物溶液時應用同一母液進行稀釋，保證底物濃度的準確性。各種試劑的加量也應準確，并嚴格控制準確的酶促反應時間。