細胞的制備和異核體的構建
| 實驗材料 | 小鼠細胞 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 胰酶 PBS |
| 儀器、耗材 | 玻璃蓋玻片 |
| 實驗步驟 | 細胞的共培養 1. 融合前 12~24 小時，將小鼠細胞鋪到無菌的玻璃蓋玻片使其能在上面充分附著和伸展。 2. 融合前 3 到 4 小時，用胰酶消化下人細胞，鋪到載有小鼠細胞的玻璃蓋玻片上，人細胞的數量應等于或略高于鼠細胞的數量，這也是為了使異種融合效果更好。 3. 再將共培養物在 37℃ 孵育 2~3 小時，以使人細胞能附著到蓋玻片上而又不會過分伸展。此時可加入放線菌酮（CHX；50~100 μg/ml）以阻止新蛋白合成。 異核體形成 4. 用預熱的不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 溫和地沖洗兩次帶有共培養物的蓋玻片。 5. 用小鑷子夾起蓋玻片，控干多余的 PBS，帶細胞的一面朝下放到一滴預熱的 50% PEG 的 PBS 溶液上。 6. 將蓋玻片在 PEG 中準確地孵育 2 分鐘。 7. 拿起蓋玻片，注意不要使其滑動（會損傷細胞），用 PBS 徹底沖洗兩次。可以用一黃吸頭頂住蓋玻片的一端同時用小鑷子從另一端抬起蓋玻片，這樣可以避免蓋玻片滑動。 8. 將蓋玻片放回到培養液中（如果需要，仍然要含蛋白質合成抑制劑），孵育足夠長時間活躍穿梭的蛋白質會在融合后的 2 到 4 個小時后在異核體中的細胞核之間達到平衡。 9. 在孵育結束時固定并通透化細胞。 |