4. 菌種的保存、退化
一般來說是加甘油20%左右，-70保存；或制成干粉保存。但是在做甲醇酵母時發現了個問題，就是重組工程菌的退化現象比較嚴重，一般都是學生做得好好的，但是畢業以后下面的師弟一接手，蛋白就不表達了，或表達量非常的低。連續好幾個師兄的結果都是如此，很是奇怪。我猜測可能是由于整合入基因組，畢竟是個外源的基因，不知整合到了染色體的什么部分，會不會過段時間就給“踢”下來，或就沉寂了？E.coli在復蘇時都有抗性壓著，酵母好像沒有太合適的（不知pPICZ系列的那個抗生素好用不好用，但畢竟好貴
）。
我有個想法，是否也應像公司在做工程細胞時那樣，挑個幾十上百個，一起傳代，10幾代后仍然穩定表達的才說明基因整合到了合適的部位，不會再下來了？但是畢竟做研究生沒那么多時間來干這個，否則萬一不行畢業就困難了。有沒有其他解決方法呢？盼高手。
5. 拷貝數對表達量的影響
對于“游離”的質粒，比如E.coli的BL21表達時，質粒的拷貝數是否對表達量有所影響？當然，由于大腸表達最主要的問題經常是表達太高了形成了包涵體，所以說白了應該希望表達量更低點的可能比較多，經常嘗試各種方法（低溫、低濃度IPTG等等）來降低表達量。那么BL21中的質粒是否是單拷貝的呢（沒查過，不太清楚）？如果不是，能否通過降低拷貝數來降低表達量防止包涵體的形成呢？
至于酵母那種整合到基因組中的質粒，那么拷貝數是否對表達量有影響呢？通過我自己的經歷，個人猜測還是有的。在上面討論了菌種的退化問題，1年左右，重組的酵母表達蛋白就消失了。但是我曾經將這些蛋白表達消失的重組菌作了PCR鑒定，發現外源的片斷仍然是存在的，就是不表達了，那么是什么原因呢？我有幾種猜測：一是可能整合的位置恰好是染色體的沉寂區了，過段時間以后就沉默了，不表達了；還有一種就是會不會是原來是高拷貝的重組菌在凍存以后退化了，變成低拷貝的了（也就是可能有蛋白表達但量很低了）。當然，我后來沒有作進一步的驗證，比如做個雜交確證以下拷貝數到底多少，只是一種猜測。
那么，如何提高重組酵母菌的拷貝數呢？對于較早的PAO815質粒，采用的多是體外重組的方法達到高拷貝后再轉化；對于pPICZ系列和pPIC9k等等則分別采用Zeocin和G418抗生素篩選的方法篩選高拷貝的質粒