1.引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產，無論采用什么機器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。申能博彩公司采用的合成儀主要機型為ABI3900高通量合成儀，合成長鏈主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成儀，引物修飾和高OD數合成采用ABI394等。
亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。
第一步是將預先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5'-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5'-羥基；
第二步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5'-羥基發生縮合反應。
第三步，帶帽(capping)反應，縮合反應中可能有極少數5'-羥基沒有參加反應(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續發生反應，這種短片段可以在純化時分離掉。
第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉變為更穩定的磷酸三酯。
經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護基團DMT，重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。
通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮,脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測定OD260定量，根據定單要求分裝。
2.引物純化方式有哪些，如何選擇？
◆ C18柱脫鹽：有人稱其為簡易反相柱，它對DNA有特異性的吸附，可以被有機溶解洗脫，但不會被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實際上，它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會對普通PCR反應產生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。
◆ OPC純化： OPC純化是根據DNA保護基（DMTr基）和Cartridge柱中樹脂間的親合力作用的原理進行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大于95%。適用于40mer以下引物的純化。
◆ PAGE純：PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于95%，對長鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化特別有效。
◆ HPLC純化：HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA片段進行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點是成本較高，批量生產效率不高。
3.引物的OD數如何定量？
答：引物合成引物OD數是這樣測定的：用紫外分光光度計，波長260nm，石英比色杯，光程為1厘米，測定溶液的光密度。測定時溶液的光密度最好稀釋到0.2-1.0之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用1ml水稀釋測OD值。需要根據稀釋倍數換算出母液的OD值。
4.投訴定量不準是怎么回事兒？
答：我們偶爾收到用戶投訴定量不準的報告，出現這種情況的可能性有（1）生產人員定量錯誤。這種可能性有，但是不大，因為我們的生產人員都是經過嚴格的培訓，程序化規范操作和換算。公司內部的考核機制也使得分裝人員沒有必要故意少給用戶OD數，因為無論OD數是否達到定單要求，我們都統計為工作量，沒有達到OD數的，分裝人員將清單及時報到序列錄入部門安排重合就可以了。合成產量的高低是序列錄入部門人員的考核指標之一。一般情況下，引物都有留樣。接到用戶投訴后，我們都會找出留樣重新定量，一般都沒有問題。（2）分裝沒有問題，但引物抽干或收樣過程中，引物干粉可能意外丟失。這種情況很少見。（3）系統誤差，我們認為10%左右為允許誤差。使用過程中，引物工作濃度范圍很寬，定量上的少許偏差不影響實驗。（4）用戶沒有能夠正確理解引物OD數的含義，沒有能夠正確使用分光光度計，特別是使用微量測定；用戶沒有將OD讀數，正確地轉換成母液中OD數。這種情況比較常見。（5）用戶收到引物干粉時，打開引物管蓋前沒有離心或其他誤操作導致引物干粉部分丟失。
例如，驗證標2OD引物量是否準確，簡單的做法是： 加入1ml水，徹底溶解混勻后，取100ul, 加入900ul水，用光徑為25px的石英比色杯，波長260nm, 此時光吸收的讀數為0.2。