引物合成常見問題解析

Q1.引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種,無論采用什么機器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。

(1)    去保護：加入Deblocking脫去堿基上5'- OH的保護基團DMT，獲得游離的5'- OH；

(2)    耦合：同時加入活化劑和新的堿基，新的堿基5'-OH仍然被DMT保護，3'端被活化與溶液中游離的5'-OH發生耦合反應；

(3)    封閉：耦合反應中極少數5'- OH沒有參加反應，用封閉試劑終止其后繼續發生反應；

(4)    氧化：加入氧化劑使其由核苷亞磷酸酯形成更穩定的核苷磷酸酯。

Q2.引物合成后如何處理？

切割與脫保護基：將合成好的寡核苷酸鏈從支持物上化學切割下來。常用新鮮的濃氨水來裂解CPG與初始核苷之間的酯鍵。斷裂下來的寡核苷酸帶有自由的3'羥基。

純化：根據所合成寡核苷酸的組成和應用來選定純化的方法。常用的純化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。

定量：根據寡核苷酸在260nm處的紫外吸收來定量。

儲存：分裝抽干。

Q3.需要什么級別的引物？

根據實驗需要，確定訂購引物的純度級別。

Q4.引物的質量是不是跟序列有關？

四種堿基的性質和各自保護基的性質都有差別。所以合成難度是不一樣的。難度最大的當屬GC重復多的和序列中還有多個連續的G的引物。尤其對于后者，國內公司一般都做不了20個G以上的引物。實驗證明，如果引物中有超過三個連續G的結構，傳統方法得到的產物質量就會開始下降。而且目前通用的脫鹽、OPC和PAGE方法都無效。

鼎國昌盛生物公司擁有的HEPDZL技術能夠克服高GC或者高G含量引物的合成和純化障礙，對普通引物、高GC引物和無論長短的oligo d（G）都能得到同樣的非常好的結果。

Q5.需要合成多少OD數？

根據實驗目的確定。一般PCR擴增，2 OD引物，可以做500-1000次50ul標準PCR反應。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。

Q6.如何計算引物的濃度？

引物保存在高濃度的狀況下比較穩定。一般情況下，我們建議將引物的濃度配制成100pmol/ul，稱為保存濃度，而引物的工作濃度一般配制成10-50pmol/ul。加水的體積（微升）可直接參照合成報告單上推薦的體積，也可按下列方式計算：

V (微升)= OD數x 33 x 10000 /引物的分子量

引物的分子量可以從合成報告單上獲得。注意：1 OD260= 33 ug/ml。

Q7.如何計算引物的Tm值？

引物設計軟件都可以給出Tm，與引物長度、堿基組成及所使用緩沖夜的離子強度有關。

長度為25base以下的引物，Tm計算公式為：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

對于更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) - 600/size＊

＊公式中，Size =引物長度。

Q8.引物（含修飾）的分子量是如何確定的？

非修飾的引物的分子量（MW）在隨引物提供的報告單上可以找到。如果需要估計一個引物的分子量按每個堿基的平均分子量為324.5，引物的分子量=堿基數 x堿基的平均分子量，或按下列公式計算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod)＋(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns-62.

NA, NG, NC, NT, NI分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數量，WA, WG ,WC, WT, WI分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分別為修飾基團的數目和分子量。對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數，例如G+A混合的分子量為（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns為硫代數目，硫代每個位置增加分子量16。

常規堿基分子量

常規修飾基團分子量

Q9.如何溶解引物？

干燥后的引物質地非常疏松，開蓋前最好瞬時離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據計算出的體積加入去離子無菌水或TE(pH8.0)緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩定。

Q10.如何保存引物？

引物合成后，經過一系列處理和純化步驟，旋轉干燥而成無色或白色絮狀干粉。

干  粉：運輸時常溫運輸，-20℃可以保存一年。

儲存液：配好后分裝成幾管，避免反復凍融，-20℃可以保存半年。

工作液：常規使用，4℃保存，也可-20℃保存，但應避免反復凍融。

修飾熒光引物：需要避光保存，盡快使用為宜。

Q11.最長可以合成多長的引物？

我們合成過100base的引物，但是產率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過80base。引物越長，出現問題的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于80base的粗產品，全長引物的百分比不高，后續處理還有丟失很多，最后的產量很低。

Q12.為什么修飾引物的產量要比一般引物低，價格要高?

主要因為是修飾單體穩定性較差，偶連時間長，效率低，最后得到的產量自然低于一般的引物。修飾引物通常需要PAGE或HPLC純化，純化過程損失大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍，所以產品的價格也高。

Q13.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？

連接反應需要引物的5'磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結構，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。

Q14.為什么引物的OD260/OD280小于1.5？

需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T的含量比較高所致。下表是一個20base同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關。

Q15.同樣的OD用PAGE檢測，EB染色為什么深淺不一？

通常可以用EB染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質粒DNA)，因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA，由于堿基組成不同，形成二級結構的可能性不同，EB的染色程度也會有差異，比如Oligo(dT)等不形成二級結構，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測。

Q16.如何檢測引物的純度？

實驗室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用銀染方式染色。

Q17.已經溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時間再使用就不好了？

如果您溶解引物的水pH過低或污染了菌或核酸酶，會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。建議分裝引物，避免反復凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩定。還有一種可能性是引物沒有問題，而是PCR使用材料特別是模板的質量與先前使用的不完全一致。