最佳區域
DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。
長度
引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應。
GC含量
引物序列的 GC 含量一般為 40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的 GC含量不能相差太大
Tm值
引物所對應模板位置序列的 Tm 值在 72℃左右可使復性條件最佳。Tm 值的計算有多種方法，如按公式 Tm=4(G+C)+2(A+T)，在 Oligo 軟件中使用的是最鄰近法(the nearestneighbor method)
3′端避開密碼子第3位
如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。
選擇T
引物3′端錯配時，不同堿基引發效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。
堿基隨機分布
引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因為這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。
自身避免互補
引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個堿基的互補。
兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′ 端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續4個堿基的互補。 引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小于4.5kcal/mol，?G 值是指 DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性 [3] ），否則易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。
5′ 端中間G值應較高3′ 端較低
△G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性，△G值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5′ 端和中間△G值相對較高，而3′ 端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′ 端的△G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA 聚合反應。（不同位置的△G值可以用Oligo 6軟件進行分析）
5′ 端可以修飾
引物的5′ 端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。
引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級結構可能。
單鏈無二級結構
某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關軟件（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。
自由能
?G 值是指 DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用 3’端 ?G 值較低（絕對值不超過 9），而 5’端和中間 ?G 值相對較高的引物。引物的 3’端的 ?G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發 DNA 聚合反應。
特異性
引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。
值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。