四種堿基的性質和各自保護基的性質都有差別。所以引物設計后合成難度是不一樣的。難度最大的當屬GC重復多的和序列中還有多個連續的G的引物。尤其對于后者,一般公司都做不了20個G以上的引物。
實驗證明,如果引物中有超過三個連續G的結構,傳統方法得到的產物質量就會開始下降。而且目前通用的脫鹽、OPC和PAGE方法都無效。