張鋒發表Science雜志CRISPR新綜述

　　新一期（8月5日）的《科學》（Science）雜志發表了一篇題為“Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems”的綜述文章。瓦赫寧根大學微生物學家John van der Oos是這篇文章的通訊作者，Broad研究所的張鋒（Feng Zhang）博士是本文共同作者。

　　長期以來人們認為適應性免疫是動物的一種獨有特征。然而，發現在幾乎一半的原核基因組中存在CRISPR-Cas防御系統則顯示出了另一個方面。由 于寄生物與宿主間永無止境的軍備競賽，通過平行轉移完整的基因位點或單個模塊，導致極大的結構和功能多樣性，CRISPR-Cas 一直在快速地進化著。 CRISPR-Cas系統可分為兩個不同的種類，每種包含三大類型和多個亞型。在這篇綜述文章中，作者們探討了近期取得的CRISPR-Cas研究進展， 揭示出了一些精妙的分子機制，提供了一個有關CRISPR-Cas進化的可信的情景。他們還簡略地描述了最近開發的廣泛的基于CRISPR的應用。

　　背景

　　原核生物進化出了多個系統對抗諸如病毒和質粒等入侵物。舉例來說，這樣的防御系統包括受體遮蔽、限制-修飾(R-M)系統、DNA干擾 (Argonaute)、噬菌體排除(BREX或PGL)以及頓挫感染等，所有這些系統都以一種天然的、非特異的方式發揮作用。此外，原核生物還進化出了 適應性、可遺傳的免疫系統：CRISPR和CRISPR-Cas。將來自入侵元件的DNA序列整合到CRISPR陣列（array）中（適應階段），再將 CRISPR陣列翻譯為長pre-crRNAs并加工為短crRNAs（表達階段），引導Cas蛋白特異性降解后來接觸的同源DNA（干擾階段），賦予了 這一適應性免疫。

　　進展

　　在大多數古細菌和近一半的細菌基因組中存在著許多不同的CRISPR-Cas系統。最新的CRISPR-Cas分類表描述了兩個種類，它們各自被細 分為三大類型。結合生物化學與分子遺傳學大大推動了揭示不同CRISPR-Cas類型許多獨特的特征。此外，結構分析和單分子研究進一步增進了我們對 CRISPR-Cas功能分子基礎的認識。

　　近期取得的一些進展包括揭示出了適應階段，即加工外源DNA片段，并將其作為新的間隔序列（spacer）整合到CRISPR陣列中去時相關的一些 步驟。此外，鑒別出了三種新的CRISPR-Cas類型(IV, V和VI)，尤其是V型干擾復合物已通過實驗確定了特征。此外，能夠借助CRISPR-Cas元件，如Cas9和Cpf1很容易地切割及編程序列特異性靶 DNA，使得研究人員可將這些CRISPR-Cas元件作為高度有效的工具，用于廣泛的真核和原核生物中實現遺傳工程和基因調控。利用結構引導的工程學， 研究人員正在積極解決Cas9核酸酶造成脫靶切割這一迫切的問題。

　　展望

　　在文章中，作者們指出盡管在過去的幾年里大大增進了對CRISPR-Cas系統的認識，還有許多問題有待揭示。不斷地發現CRISPR-Cas變體 可直接測試近來提出的有關CRISPR-Cas系統進化的模塊化學說。近期發現并確定了一些新CRISPR-Cas類型的特征表明，以我們當前的知識來預 測親緣關系遙遠的CRISPR-Cas變體的功能細節能力還相對有限。因此，需要徹底地剖析新發現的CRISPR-Cas系統認識它們的生物學作用，揭示 它們的分子機制，利用它們的潛能來開發生物技術。

　　有關CRISPR-Cas生物學的一些關鍵的、懸而未決的問題包括，微生物適應性免疫的生態作用，CRISPR-Cas的高平行轉移 率，CRISPR-Cas和噬菌體編碼anti-CRISPR蛋白的共進化。當前對于CRISPR-Cas的表達調控，CRISPR-Cas在防御之外的 一些過程中所起的作用還知之甚少。關于CRISPR-Cas機制，闡明在間隔序列獲取中適應階段和干擾階段之間聯系的一些細節還不清楚。

　　當前了解甚少的一個CRISPR-Cas關鍵方面是自我/非自我識別。在CRISPR變體之間這一識別機制似乎有著很大的差異。近期比較2型效應器復合物(Cas9/Cpf1)揭示出了一些整體的結構相似性以及結構與機制差異。

　　這些CRISPR-Cas變體或許可以轉化為互補的生物技術應用。結合一些用于基礎研究的創新工具，CRISPR相關效應器復合物將幫助開發出新一代的抗病毒預防藥物和療法。對于人類基因治療應用，作者們指出，仍然需要不斷地改進安全、有效地將Cas9/Cpf1和gRNAs傳遞到細胞和組織中去的方法。進一步認識有關CRISPR-Cas結構、功能和生物學的基本細節，尤其是確定新Cas效應器蛋白的特征，對于優化及進一步擴展CRISPR-Cas系統各種應用至關重要。