弱陽離子交換色譜中疏水作用對蛋白保留的影響

由于用離子交換色譜(IEC)分離后所得的蛋白能保持較高的活性,且不用昂貴和有毒的有機溶劑作流動相,在蛋白質科學和蛋白藥物領域中有著廣泛的應用。為提高蛋白的質量回收率,IEC的固定相表面應具有盡可能高的親水性,以消除因疏水性對蛋白產生的非特異性吸附。然而眾所周知,在過去一個世紀以來所設計的一切色譜介質都只是溶質以一種力與其固定相的相互作用的一維色譜,一般不能滿足蛋白純化中純度大于95%的要求,故常常要用二維液相色譜(2D2LC)及多維液相色譜(mD2LC)模式進行蛋白分離[124]。

Kennedy等[5]和Melander等[6]分別發現了陰離子交換色譜(AEX)具有疏水色譜(HIC)的性質,并稱其為混合機理。衛引茂等[7]也發現了HIC柱同時具有IEC機理,統稱為混合保留機理。他們均繪出了能表達蛋白雙保留機理特征的“U”型洗脫曲線圖。柯從玉等[8]用一種特殊的色譜固定相同時具有HIC和弱陽離子交換(WCX)兩種好的色譜分離功能,從而用一根色譜柱和不同的流動相就能實現通常要用兩根WCX和HIC色譜柱單獨使用的蛋白分離效果,稱該色譜柱為二維色譜柱(2Dcolumn),在此基礎上又提出了在線單柱二維液相色譜法(On2lineTwo2dimensionalLiquidChromatographybyaSingleColumn,On2line2D2LC21C)以實現天然蛋白的快速分離[9]。

為大大加快天然蛋白的純化速度,本文使用了四種適用范圍較廣,且具有代表性的WCX商品柱以探索其是否能成為2D色譜柱的可能性。為此,研究了它們在WCX和HIC模式下對蛋白的相互作用及分離特征。發現蛋白在這四種WCX柱中均存在有HIC保留機理,表明了WCX中存在疏水作用是一個普遍存在的現象,對蛋白分離存在著有利和不利兩方面的影響。

1.1主要儀器與試劑

LC220A高效液相色譜儀(日本,島津公司),包括兩臺LC220AT泵,一臺SPD220A紫外可見檢測器,Rheodyne7725i手動進樣閥和N2000色譜工作站;PB210型pH計(德國,SartoriusAG);KQ2250型超聲儀(上海昆山檢測儀器廠);CascadaLS型純水儀(PallCo.Ltd,美國)。細胞色素c(Cytc,馬心肌)、核糖核酸酶A(RNaseA,牛胰臟)、肌紅蛋白(Myo,馬心肌)、溶菌酶(Lys,雞蛋清)、α2糜蛋白酶(α2Chy,牛胰臟)、胰島素(Ins,牛胰臟)、α2淀粉酶(α2Amy)均購自Sigma公司。

1.2色譜條件

色譜柱Ⅰ:TSKgelCM25PWcolumn(75×7.5mmi.d.);色譜柱Ⅱ:Shim2packWCX21column(50×4.0mmi.d.);色譜柱Ⅲ:Shim2packWCXPA2CM(100×8.0mmi.d.);色譜柱Ⅳ:PolyCATATM(150×4.6mmi.d.)。

WCX流動相A液:0.050mol/LKH2PO4(pH=6.5);B液:1.0mol/LNaCl 0.050mol/LKH2PO4(pH=6.5);線性梯度:B液0%～100%30min。HIC流動相A液:3.0mol/L(NH4)2SO4 0.050mol/LKH2PO4(pH=6.5);流動相B液:0.050mol/LKH2PO4(pH=6.5);線性梯度:柱Ⅰ、Ⅱ、ⅣB液0%～100%,柱ⅢB液17%～100%30min。流速1.0mL/min;檢測波長為280nm;柱溫:室溫。