影響電泳色譜儀泳動速度的因素有電場、緩沖液和支持介質等。
一、電場：
1、電場強度：
電場強度對帶電顆粒的泳動速度起著十分重要的作用。電場強度越大，泳動速度越快，單位時間內顆粒的遷移距離越大，分離時間越短。
根據電場強度大小，電泳可分為常壓電泳（100～500V）和高壓電泳（500～5000V）。常壓電泳的電場強度一般為2～10V/cm，分離時間長，需數小時到數天，多用于分離大分子物質。高壓電泳的電場強度一般為20～200V/cm，分離時間短，有時僅需數分鐘，多用于分離小分子物質。
2、電極和電極反應：
電泳的電極材料大都采用鉑金絲，鉑金絲的安放位置影響電場強度。若兩極間鉑金絲位置放的不好，電場強度不均勻，常會使電泳譜帶彎曲或同一樣品的泳動速度不同。
通電過程中電極兩端會發生電解反應：
正極（氧化極）：2H2O → 4H+ + O2+4eˉ
負極（還原極）：2H2O + 2eˉ→ 2OHˉ+ H2
在電泳過程中，正負極均有氣體產生，負極有密集的氫氣泡，正極有較大的氧氣泡。電泳后，兩個電泳槽的pH值會相差很大（2～4個pH）。另外，在電泳過程中會產生熱量，尤其是高壓電泳，因此高壓電泳槽需有冷卻裝置，常壓電泳可放在冰箱中降溫。
二、緩沖液：
緩沖液的成分和濃度決定并穩定支持介質的pH和溶液的離子強度，影響帶電顆粒的泳動速度。
1、成分：
對緩沖液成分總的要求是不使樣品變性，不改變支持介質的理化性質，不影響電泳后染色，有利于電泳進行和樣品分離。
常用緩沖液有巴比妥（鈉）、硼酸（鈉）、磷酸鹽和Tris等。根據電泳類型和分離對象選用緩沖液成分，如用紙電泳分離血清蛋白可選用巴比妥－巴比妥鈉緩沖液，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離酶可選用Tris－甘氨酸緩沖液。
2、濃度：
緩沖液的濃度主要影響溶液的離子強度。離子強度是離子濃度和離子價數的函數，離子強度越高，帶電顆粒的泳動速度越慢。
緩沖液的濃度過高，帶電顆粒會吸引相反符號的離子聚集在其周圍，形成一個離子擴散層，一方面影響顆粒所帶的電荷量，降低其在電場中的電場力，從而影響泳動速度；另一方面，當加以電場時，顆粒向與其電荷相反的電極移動，即帶正電荷的顆粒移向負極，帶負電荷的顆粒移向正極，離子擴散層由于攜帶過剩的與顆粒符號相反的電荷，則向相反方向移動，因顆粒與離子擴散層之間的靜電引力，使顆粒的泳動速度減慢。
緩沖液的濃度過低，離子強度低，影響溶液的導電性；使樣品分子擴散加重，分辨率下降。因此，緩沖液的離子強度一般控制在0.02～0.2之間。
3、pH：
溶液的pH值決定帶電顆粒的解離程度，決定顆粒所帶電荷的性質和數量，決定顆粒的遷移方向。如蛋白質，當溶液的pH低于蛋白質等電點時，蛋白質分子帶正電荷成為陽離子。當溶液pH大于等電點時，蛋白質分子帶負電荷成為陰離子。pH值離等電點越遠，顆粒所帶凈電荷越多，泳動速度越快，反之越慢。因此，當分離某一蛋白質混合物時，應選擇一種能擴大各種蛋白質所帶電荷量差異的pH緩沖液。
電泳時，正負電極接線要隨pH變化而變化。如在堿性條件下，蛋白質帶負電荷，正極應接在遠離加樣品的一方，以使蛋白質在支持介質上定向遷移。
三、支持介質：
多數電泳都有支持介質，如紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳等。支持介質的結構和性質對帶電顆粒的泳動速度影響很大，主要表現為對樣品的吸附、產生電滲和分子篩效應。
1、吸附：
支持介質對樣品的吸附使帶電顆粒泳動過程中的摩擦力增大，導致泳動速度減慢，峰拖尾，分辨率下降。
2、電滲：
電場中的液體相對于支持介質的移動稱為電滲。如在紙電泳中，由于組成紙的纖維素帶負電荷，使與紙接觸的水層帶正電荷（H3O+），使溶液在電場作用下向負極移動，并帶動樣品向負極移動。如果顆粒原來帶正電荷，向負極移動，由于電滲使顆粒移動得更快，反之變慢。紙和淀粉等支持介質的電滲現象明顯，醋酸纖維薄膜和聚丙烯酰胺凝膠的電滲較小。
3、分子篩效應：
分子篩是凝膠電泳的特性。用來作電泳的凝膠是有彈性且有網狀結構的半固體物質，具有分子篩作用，使小顆粒易透過，而大顆粒不易透過。凝膠的分子篩效應對樣品分離有利。