細菌藥敏試驗所用的培養基種類較多，多數情況下，采用WHO組織統一要求的M—H培養基，這種培養基中含有的低胸腺嘧啶是與磺胺類藥物競爭的物質，因此進行的藥敏試驗效果較好。此外，還有適量的Ca、Mg，在培養基中起到觸媒的作用。但是，有些細菌對培養基中的成分有特殊的要求，特殊的菌要用特殊的培養基才能進行藥敏試驗。例如，流感嗜血桿菌的藥敏試驗培養基用HTM瓊脂；淋球菌的藥敏試驗培養基用加5%羊血的巧克力M—H瓊脂；肺炎鏈球菌的藥敏實驗用M—H瓊脂加5%的脫纖維羊血培養基。培養基中還有適量的Ca、Mg，在培養基中起到溶酶的作用，其含量的變化，可影響氨基糖苷類和四環素對銅綠假單胞菌的試驗結果，含量過高，抑菌圈會變小，含量過低，抑菌圈會大得不可接受。
細菌藥敏試驗的培養基厚度大約為4mm，若培養基厚度大于4mm，會使細菌出現耐藥；若小于4mm，本應耐藥的易出現敏感。所以，試驗時一定不要把藥敏紙片放在中央部位，而應均勻地排布在平皿周圍的培養基上。制作藥敏試驗的培養基用水，主要是Ca、Mg、A1等礦物質離子，也在很大程度上影響著藥敏試驗的結果。