①退火步驟的嚴格性:提高退火溫度可以減少不匹配的雜交,從而提高特異性。
②減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發及錯誤延伸。
③引物二聚體是最常見的副產品,降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發,尤其是引物的二聚化。
④改變MgCl2(有時KCl)濃度可以改進特異性,這可能是提高反應嚴格性或者對Taq酶的直接作用。
⑤模板中如果存在次級結構,例如待擴增的片段易自行形成發夾結構時,可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脫氮-2’-脫氧鳥苷-5’-三磷酸(7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate)(de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3:1的混合物(150μmol/l de7GTP 50μmol/L dGTP)代替200μmol/l dGTP,則可阻非特異性產物的生成。