1.模板純度,有較多蛋白或其他雜質時,會一定程度影響pcr效率;2.模板量,過高的模板量反而會降低pcr效率和特異性;3.引物,引物的長度需要再效率和特異性間獲得優化,其次要控制引物gc含量;4.聚合酶,要考慮酶的保真率和速度;5.mg離子濃度,mg離子濃度過高會降低特異性,濃度過低會降低效率;6.退火溫度:退火溫度低,效率會高,但特異性降低;退火溫度高,效率降低,但特異性會提高;需優化。
標準的PCR反應體系:10×擴增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umol/L引物各10~100pmol模板DNA0.1~2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至......