04
第四個應用實例，是對病毒基因組復制的觀察。標題為：利用STED超高分辨顯微鏡觀察復制的HSV-1病毒【4】。值得一提的是，本文由中科院昆明動物所周巨民老師課題組與徠卡公司合作完成。
病毒基因組復制是單純皰疹病毒 1 (HSV-1)
溶解感染周期的重要事件。目前由于檢測和觀察方法的局限，病毒復制過程的細節仍難以捕捉。為了獲得更加詳細的 HSV-1
復制機制，本文使用了STED受激發射損耗顯微鏡，結合熒光原位雜交 (FISH) 和免疫熒光，對HSV-1 復制過程進行了精細觀察。
作者設計了位于HSV-1病毒基因組兩端的探針，分別以DIG（綠色）和Biotin（紅色）進行標記，在病毒復制的早期和晚期，分別成像觀察。STED成像發現，在復制的早期，紅綠兩色信號的共定位程度較高；而在復制后期，兩個系數均發生了明顯降低，表明HSV-1
基因組在復制過程中經歷了從緊湊到松弛的動態結構變化，同時需要占用較大的空間進行復制。
05
第五個應用實例，是對病毒侵染和傳播過程捕獲的研究。標題為：ARP2和病毒誘導的絲狀偽足促進了人類呼吸道合胞體病毒的傳播【5】。
利用STED超高分辨顯微鏡進行成像，發現感染了RSV病毒的細胞（圖A第一行，標記為A和C）外存在大量的絲狀偽足（紅色），且富集有大量病毒顆粒（綠色）；暗示可通過絲狀偽足將RSV病毒傳遞給鄰近細胞。而在ARP2敲除的細胞中（圖A第二行），即便感染了RSV病毒，細胞的絲狀偽足數量都大量減少，病毒在細胞間的傳播不明顯。放大圖像（圖B），可觀察到RSV病毒主要分布在絲狀偽足的尖端，進一步驗證了病毒可通過誘導絲狀偽足的產生來促進其在細胞間的傳播。
如何進一步提高STED分辨率？
根據公式我們可以知道，通過增加STED激光功率就可直接增加圖像的分辨率，這個方法最為簡單；但問題是不利于活細胞成像。那么如何在不提高激光功率的前提下，進一步提高STED分辨率呢？有以下三種方法，分別是gated
STED，gated STED + Lightning，和徠卡新推出的τ-STED。
01
以兩個距離76nm的DNA Origami為例，gated STED在不改變STED激光功率的前提下，逐步縮小熒光壽命的檢測范圍，可逐步提高分辨率，清晰地分辨兩個點信號。
02
對中心粒的gated STED + Lightning成像結果，分辨率（半高寬）可達22nm！
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新一代STED：τ-STED，即將STED和超快速的熒光壽命相結合，實時呈現超高清分辨圖像。它在已有STED優勢的基礎上，可以更低激光功率獲得更高圖像分辨率，進一步拓展熒光染料的選擇，非常適合長時間的活細胞成像。
結語
徠卡STED擁有13年的研發、技術和服務經驗，也具有以下突出優勢特點，是病毒學研究的絕佳利器：
“純光學”超高分辨顯微技術，所見即所得
全光譜、多色超高分辨成像，提供592nm/660nm/775nm三根 STED譜線
專為STED設計的多款滿足不同應用需求的物鏡
使用常規熒光染料及熒光蛋白，制樣簡單、方便
τ-STED低光毒性，更適合活細胞超高分辨成像
快速掃描頭能夠更好的保護樣品
LAS X Navigator能夠輕松尋找目標視野
此外，整個STED是搭載在徠卡共聚焦平臺上的，因此也擁有共聚焦的所有優點。相信徠卡STED超高分辨顯微鏡能夠更多地貢獻超高清圖像結果，助力病毒學和生命科學研究發展。
參考文獻：
【1】Chojnacki J, Staudt T, Glass B, et al. Maturation-dependent HIV-1
surface protein redistribution revealed by fluorescence nanoscopy.[J].
Science, 2012, 338(6106): 524-528.
【2】Hanne J, Gottfert F, Schimer J, et al. Stimulated Emission Depletion
Nanoscopy Reveals Time-Course of Human Immunodeficiency Virus
Proteolytic Maturation[J]. ACS Nano, 2016, 10(9): 8215-8222.
【3】Wang IH, Suomalainen M, Andriasyan V, et al. Tracking viral genomes
in host cells at single-molecule resolution. Cell Host Microbe.
2013;14(4):468–480.
【4】Li Z, Fang C, Su Y, et al. Visualizing the replicating HSV-1 virus
using STED super-resolution microscopy[J]. Virology Journal, 2016,
13(1): 65-65.
【5】Mehedi M, Mccarty T, Martin S E, et al. Actin-Related Protein 2
(ARP2) and Virus-Induced Filopodia Facilitate Human Respiratory
Syncytial Virus Spread[J]. PLOS Pathogens, 2016, 12(12).