試劑、試劑盒 ddNTP 延伸 終止混合物酶及其緩沖液AmpliTaq CS 或其他無外切酶活性的 DNA 聚合酶循環測序緩沖液熱穩定的 DNA 聚合酶核酸和寡核苷酸模板 DNA
儀器、耗材 小離心管 或者微孔板熱循環儀
實驗步驟
材料
溶液和緩沖液
貯存液、緩沖液和試劑的配方請參照附錄 1。
將貯存液稀釋到適當的濃度。
ddNTP 延伸/終止混合物
ddNTP 溶液：四種 ddNTPs, 各 5.0 mmol/L
dNTP 溶液：四種 dNTPs, 各 1.0 mmol/L
EDTA(0.05mol/L,pH8.0)
甲酰胺上樣緩沖液
Tris-Cl(1mol/L,pH8.0)
酶及其緩沖液
AmpliTaq CS 或其他無外切酶活性的 DNA 聚合酶（5units/ul)。
5X 循環測序緩沖液
200 mmol/LTris-Cl(pH8.8)
25 mmol/LMgCl2
熱穩定的 DNA 聚合酶
選擇酶時，請參照本章介紹中及方法 5 中表 12-19 的介紹選擇測序系統。該方法依據 AmpliTaqCS 寫出. 但其他類似的熱穩定酶同樣可用。
核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物，5'端由 33P 或 32P 放射性標記
請見第 10 章，方案 2。
模板 DNA
質粒、黏粒、λ噬菌體和噬菌體 M13DNA 以及通過第 1~4 章中任何方法得到的 DNA 都可以用作模板。表 12-12 表明了每種摸板的需要量（同時參考表 12-4)。
特殊裝置
小離心管（0.5 ml) 或者微孔扳（柔軟，熱穩定，96 個 300ul 溶劑 U 型孔）
這些板可被標記以不同彩色和/或標上 C、T、A 和 G 字樣。
設計好的熱循環程序（見步驟 5)。
方法
1.將每一種ddNTP混合物（參考表12-11)各4ul放入相應的0.5ml離心管或微孔板中。置于冰上。
2.在每管/孔中加人：
雙鏈DNA模板 10~100fm
1.5pmoles 5'端由32P放射性標記的引物 1.0ul
5X循環測序緩沖液 2.0ul
加水 至5.0ul
*如果使用33P末端標記的引物：使用5pm標準制備的由33P放射性標記的寡核苷酸(參見附錄方法：使用PCR和[a-32P]dNTP內部標記進行的循環測序反應為保證測序混合物的化學計量。可在不增加反應體積的情況下將DNA量增加3倍（30—300fm）。
3.在1X循環測序緩沖液中將AmpliTaq CS聚合酶溶解至0.5~1.0U/ul。將1ul溶解好的酶溶液加入孔或管中。
4.輕彈管壁或搖動微孔板使物質混合。如果需要，在反應上加一滴礦物油，蓋上管蓋，2000r/m離心2s。確認礦物油未被紫外線照射過.否則會產生PCR的強抑制劑。
5.將管或微孔板放入PCR儀，預熱到95°C。依據以下程序操作。
重要：開始程序時切勿拖延。保證在95°C預熱時間不趙過3min。否則DNA聚合酶會失活。
6.取出板或管，分別加入5ul甲酰胺加樣緩沖液。
7.反應物可在-20°C保存5天或直接用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（方案8,9,10,11和12）。變性后（100°C 2min),在冰上驟冷，每種反應物用3ul上樣。