三、碳源和氮源利用試驗
1．枸櫞酸鹽利用試驗
(1)原理：某些細菌能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源，而在此培養基上生長，并分解枸櫞酸鹽生成碳酸鈉，使培養基變堿性。。
(2)方法：將待檢菌接種于枸櫞酸鹽培養基上，置35℃孵育1~4d，逐日觀察結果。
(3)結果：若用溴麝香草酚蘭指示劑，斜面出現菌落或菌苔，培養基變藍色為陽性；無菌落生長，培養基綠色為陰性。
(4)應用：可用此試驗作細菌種屬間鑒定。埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常陽性，粘質和液化沙雷菌和某些變形桿菌及枸櫞酸桿菌陽性。此外，銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌和嗜水氣單胞菌也能利用枸櫞酸鹽。
2．丙二酸鹽利用試驗
(1)原理：某些細菌能利用丙二酸鹽作為唯一碳源，丙二酸鹽被分解生成碳酸鈉，使培養基變堿。
(2)方法：將待檢菌接種于丙二酸鹽培養基中，置35℃孵育24~48h，觀察結果。
(3)結果：培養基由綠色變為藍色為陽性。顏色無變化為陰性。
(4)應用：腸桿菌科中亞利桑那菌和克雷伯菌屬為陽性，枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬有不同生物型反應，其它各菌屬均為陰性。
3．醋酸鈉利用試驗
(1)原理：細菌利用銨鹽作為唯一氮源，同時，利用醋酸鹽作為唯一碳源時，可在醋酸鹽培養上生長，分解醋酸鹽生成碳酸鈉，使培養基變為堿性。
(2)方法：將被檢菌接種于醋酸鹽培養基中，置35℃孵育2~7d，逐日觀察結果。
(3)結果：培養基上有細菌生長，并變為藍色為陽性。
應用：主要用于大腸埃希菌和志賀菌屬的鑒別，前者為陽性，而后者為陰性。
4．馬尿酸鈉水解試驗
(1)原理：某些細菌可具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸與三氯化鐵試劑結合，形成苯甲酸鐵沉淀。
(2)方法：將待檢菌接種于馬尿酸鈉培養基中，置35℃孵育48h，離心沉淀，取上清液0.8ml，加入三氯化鐵試劑0.2ml，立即混勻，經10~15min觀察結果。
(3)結果：出現恒定之沉淀物為陽性。
應用：主要用于B群鏈球菌的鑒定。
5、乙酰胺利用試驗
(1)原理：許多非發酵菌產生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經脫酰胺作用釋放氨，使培養基變堿。
(2)方法：將被檢菌接種于乙酰胺培養基中，置35℃孵育24~48h，觀察結果。
(3)結果：培養基由綠色變為藍色為陽性。如不生長，或稍有生長，但培養基顏色不變為陰性。
(4)應用：主要用于非發酵菌的鑒定。銅綠假單胞菌、去硝化產堿桿菌、食酸假單胞菌為陽性，其它非發酵菌大多數為陰性。四、酶類試驗
1.氧化酶試驗
(1)原理：氧化酶又稱細胞色素氧化酶，是細胞色素氧化酶系統中的最終呼吸酶。此酶并不直接與氧化酶試劑起反應，而是先使細胞色素C氧化，然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產生顏色反應。因此，本試驗結果與細胞色素C的存在有關。
(2)方法：取潔凈濾紙條，沾取菌落少許，加氧化酶試劑（10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液或10g/L鹽酸二甲基對苯二胺水溶液）1滴，1min內觀察結果。也可將試劑滴加到菌落上進行試驗。
(3)結果：陽性者立即變粉紅色，5~10s內呈深紫色。無色為陰性。
(4)應用：用于奈瑟菌屬的菌種鑒定，該屬細菌均陽性。此外，也用于假單胞菌屬與腸桿菌科細菌的區別，前者陽性，而后者陰性。莫拉菌屬、產堿桿菌屬等均為陽性。
注意事項： ①試驗時應避免接觸含鐵物質，以免出現假陽性。②10g/L鹽酸四甲基對苯二胺或10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液為無色溶液，在空氣中易被氧化而失效，故應經常更換新試劑，并盛于棕色瓶中，若試劑已變成深藍色，應棄去不用。
2．觸酶試驗
(1)原理：觸酶又稱過氧化氫酶，具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫成為水和原子態氧，繼而形成氧分子，出現氣泡。
(2)方法：取潔凈玻片1張，用接種環挑取細菌，加3％H2O2 1滴，立即觀察結果。
(3)結果：若立即出現大量氣泡為陽性。無氣泡為陰性。
(4)應用：大多需氧和兼性厭氧菌均產生過氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故常用此試驗來鑒定。此外，金氏桿菌屬的細菌也為陰性。分枝桿菌的鑒別則用耐熱觸酶試驗，結核分枝桿菌為陰性，戈氏分枝桿菌和地分枝桿菌為陽性。
注意事項：①3％H2O2溶液要新鮮配制。②不宜用血瓊脂平板上生長的菌落，因紅細胞含有觸酶，可致假陽性反應，③取對數生長期的細菌。
3．凝固酶試驗
(1)原理：凝固酶試驗是鑒定葡萄球菌致病性的重要試驗。致病性葡萄球菌可產生兩種凝固酶，一種是與細胞壁結合的凝聚因子，稱結合凝固酶，它直接作用于血漿中纖維蛋白原，使發生沉淀，包圍于細菌外面而凝聚成塊，玻片法陽性結果是由此凝聚因子所致；另一種凝固酶是分泌至菌體外，稱為游離凝固酶，它能使凝血酶原變成凝血酶類產物，使纖維蛋白原變為纖維蛋白，從而使血漿凝固。試管法可同時測定結合型和游離型凝固酶。
(2)方法:
①玻片法：在一張潔凈玻片中央加1滴生理鹽水，用接種環取待檢培養物與其混合（設陽性和陰性對照）制成菌懸液，若經10~20s內無自凝現象發生，則加入人或兔新鮮血漿1環，與菌懸液混合，觀察結果。②試管法：于試管內加1：4稀釋的兔或人血漿0.5ml，再加1~2個待試菌菌落，置37℃水浴，每30min觀察1次結果。
(3)結果：①玻片法：5~10s內出現凝集者為陽性。②試管法：如有凝塊或整管凝集出現為陽性。2h后無上述現象出現，則放置過夜后再觀察。
(4)應用：本試驗僅用于致病性葡萄球的鑒定。
注意事項：①玻片法為篩選試驗，陽性、陰性均需進行試管法測定。②血漿必須新鮮。③應使用肝素而非枸櫞酸鹽作抗凝劑抗凝的血漿。④本試驗也可用市購的膠乳凝集試驗試劑盒測定。
4．DNA酶試驗
(1)原理： 某些細菌能產生DNA酶，水解外源性DNA使之成為寡核苷酸。DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸則不會。故在DNA瓊脂平板上加鹽酸后，可在菌落周圍形成透明區。
(2)方法：在DNA瓊脂平板上點種待檢菌，35℃孵育18~24h，用1 mol/L鹽酸傾注平板，觀察結果。
(3)結果：如菌落周圍有透明區者為陽性，無透明區為陰性。
(4)應用：主要用于腸桿菌科及葡萄球菌屬某些菌種的鑒定。沙雷菌、變形桿菌和金黃色葡萄球菌DNA酶均陽性。
5．膽汁溶菌試驗
(1)原理：膽汁或去氧膽酸鈉能導致某些細菌溶解，一方面是由于膽汁或去氧膽酸鈉降低了細菌細胞膜上的表面張力，使細菌的細胞膜破損或使菌體裂解。另一方面可能與激活細菌體內的自溶酶有關。
(2)方法：①試管法：用純培養物制備1ml生理鹽水濃菌懸液，pH調至7.0，分裝兩支試管，各0.5ml。其中一管加0.5ml
100g/L去氧膽酸鈉為試驗管，另一管加0.5ml生理鹽水作對照。35℃孵育每小時觀察1次結果。②平板法：在血平板上選取單個可疑菌落，作好標記，直接在菌落上加1接種環20g/L去氧膽酸鈉（pH7.0），置35℃孵育30min（平板不要翻轉）觀察結果。
(3)結果：①試管法：在3h內液體透明為陽性。②平板法：如菌落消失，僅留下溶血區為陽性，菌落不消失為陰性。
(4)應用：用于肺炎鏈球菌的鑒定。
6．硝酸鹽還原試驗
(1)原理：硝酸鹽還原反應包括兩個過程，其一是在合成代謝過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉化為氨基酸和細胞內其它含氮化合物；另一是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統中的終末受氫體。硝酸鹽還原過程可因細菌不同而異。有的細菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌等；有的細菌可使其還原為亞硝酸鹽和離子態的銨；有的細菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如沙雷菌屬；有的細菌還可以將其還原產物在合成性代謝中完全利用。硝酸鹽或亞硝酸鹽如果還原生成氣體的終末產物如氮或氧化氮，則稱為脫硝化或脫氮化作用。某些細菌能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者與α-萘胺結合生成N-α萘胺偶苯磺酸。
(2)方法：將待檢菌接種于硝酸鹽培養基（內含小倒管）中，35℃孵育1~4d。將甲、乙等量混合液（用時混合）0.1ml加于試管內，立即或10min內觀察結果。
(3)結果：出現紅色為陽性反應。如欲觀察有無氮氣產生，可于培養基管內加1只小倒管，有氣泡產生，則表示有氮氣生成。如欲檢查培養基中硝酸鹽是否被分解，可取鋅粉少許加入培養基內，如出現紅色表明硝酸鹽仍存在；若不出現紅色，表示硝酸鹽已被分解。
(4)應用：本試驗廣泛用于細菌鑒定。腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；假單胞菌屬中有的細菌能產生氮氣，如銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、斯氏假單胞菌，有的則能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，如鼻疽假單胞菌等；厭氧菌如韋榮菌也能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。
7．卵磷脂酶試驗
(1)原理：細菌產生的卵磷脂酶，經鈣離子作用，能迅速分解卵黃或血清中的卵磷脂形成混濁沉淀狀的甘油酯和水溶性磷酸膽堿。
(2)方法：取待檢菌劃線接種或點種在卵黃瓊脂平板上，置35℃孵育3~6h，觀察結果。
(3)結果：3h后在菌落周圍形成乳白色混濁，即為卵磷脂酶試驗陽性，6h后該混濁圈可擴大到直徑5~6mm。
(4) 應用：該試驗主要用于厭氧的鑒定。產氣莢膜梭菌和諾維梭菌為陽性，其他梭菌為陰性。蠟樣芽孢桿菌亦為陽性。
8．磷酸酶試驗
(1)原理：磷酸酶是磷酸脂的水解酶，可使單磷脂水解，其反應可根據反應基質不同而異，如用磷酸酚酞為基質，經磷酸酶水解后可釋放酚酞，在堿性環境中呈紅色。
(2)方法：取待檢菌接種于磷酸酚酞瓊脂平板上，置35℃孵育18~24h，于平皿蓋內加1滴濃氨水，熏蒸片刻，觀察結果。亦可用液體培養基，經孵育后，向管內加400g/L氫氧化鈉溶液1滴，觀察結果。
(3)結果：菌落變為紅色者為陽性。
(4)應用：主要用于致病性葡萄球菌與非致病性葡萄球菌的鑒別，前者為陽性，后者為陰性。