微生物所噬菌體抑制細菌CRISPRCas系統機制研究中獲進展

　　原核生物通過一系列的防御系統來抵抗噬菌體等寄生生物的攻擊。與真核生物的免疫系統類似，原核生物的防御系統也可以分為天然免疫系統和獲得性免疫系統。天然免疫系統又包括限制性修飾（Restriction-Modification, R-M）系統、DNA干擾、毒素-抗毒素系統等，是非特異性的防御措施；而獲得性免疫系統是高度特異性的防御手段，其典型代表為CRISPR-Cas系統。近年來，針對CRISPR-Cas系統的作用機制研究取得了一系列進展，這類系統的序列特異性核酸剪切活性能夠對多種細胞和生物的基因組進行有效編輯，在基因工程和生物醫學等多個領域顯示出了巨大應用潛力。其中最受關注的是Cas9（type II）和Cas12a（type V）系統，二者都被設計和改造成高效精準的基因編輯工具，而Cas13a（type VI）系統也被開發成為高靈敏性的核酸檢測系統。

　　 為了逃逸宿主的CRISPR-Cas免疫作用，噬菌體也進化出了多種anti-CRISPR（Acr）蛋白來抑制宿主菌體內CRISPR-Cas系統的功能。目前為止，研究人員已發現了一系列針對type I和type II CRISPR-Cas系統的Acr蛋白，并且其中多個Acr蛋白的抑制機理已被闡明，具有非常明顯的特異性和多樣性。2018年，Jennifer A. Doudna和Joseph Bondy-Denomy兩個課題組分別利用不同的方法發現了三個靶向type V效應蛋白Cas12a的Acr蛋白（AcrVA1、AcrVA4、AcrVA5）并在哺乳動物細胞內顯示出有效抑制活性。隨后，Dong等人發現AcrVA5通過對Cas12a進行乙酰化修飾來影響PAM基序的識別，從而抑制靶標雙鏈DNA（dsDNA）的結合。同時，Knott等人報道AcrVA1能夠剪切與Cas12a結合的CRISPR RNA (crRNA)的spacer序列，從而阻斷DNA靶標鏈與crRNA互補配對；并且他們通過生化實驗證明了AcrVA4能夠影響靶標DNA的結合，但其具體作用機理仍不清楚。此外，在這三個Acr蛋白中，AcrVA4具有最高的抑制效率，并且能同時抑制莫拉氏菌（Moraxella bovoculi, MbCas12a）和毛螺菌編碼的Cas12a（Lachnospiraceae bacterium, LbCas12a）蛋白活性，而LbCas12a已被廣泛應用于多種細胞的基因編輯。因此，揭示AcrVA4抑制Cas12a活性的分子機制對于開發有效的基因編輯調節工具具有重要意義。

　　通過體外結合實驗，中國科學院微生物研究所中科院院士高福與研究員施一團隊發現AcrVA4能夠與LbCas12a-crRNA二元復合物以及切割前后兩種狀態的LbCas12a-crRNA-dsDNA三元復合物結合，但是不能結合單純的Cas12a蛋白，表明AcrVA4識別Cas12a的特定構象。隨后，研究人員利用冷凍電鏡單顆粒三維重構技術，解析了AcrVA4與LbCas12a-crRNA結合的原子分辨率的三維結構。結構顯示AcrVA4以同源二聚體形式存在，并且與一個或兩個LbCas12a-crRNA二元復合物進行結合。在兩種形式的復合體中，AcrVA4通過類似的機制與Cas12a相互作用，表明兩種結合模式具有相同的抑制作用（圖1）。進一步結構分析表明，AcrVA4利用其C端結構域與LbCas12a的多個結構域發生相互作用并鎖定其構象，從而阻止靶標DNA與crRNA的spacer序列進行互補配對，進而阻斷DNA切割反應。有趣的是，當AcrVA4與切割前狀態的LbCas12a-crRNA-dsDNA三元復合物（R-loop狀態）相互作用時，能夠將結合的dsDNA剝離下來，從而拯救被捕獲的靶標DNA使其不被切割。此外，AcrVA4還能與切割后的LbCas12a-crRNA-dsDNA復合物結合并具有較高親和力，這可能會干擾Cas12a被新的crRNA重置，阻斷酶的循環利用過程（圖2）。

　　該項工作系統地研究了AcrVA4抑制CRISPR-Cas12a系統的分子機制。與其他已知Acr蛋白的單一抑制機制不同，AcrVA4能夠在反應過程中的多個步驟影響Cas12a發揮活性。這些發現拓展了人們對于Acr蛋白作用機制的了解，為設計可調控的基因編輯系統提供了重要理論基礎。相關成果已在《美國國家科學院院刊》（PNAS）雜志在線發表，題為Structural insight into multistage inhibition of CRISPR-Cas12a by AcrVA4。微生物所助理研究員彭如超、中國科學院大學存濟醫學院博士生李志騰和中國科學技術大學博士生徐穎為論文共同第一作者；高福和施一為論文共同通訊作者。此外，南方科技大學冷凍電鏡中心主任王培毅和微生物所研究員齊建勛等也提供了大力支持。該項目獲得中科院重點戰略性先導科技專項（B類）、國家科技重大專項、國家自然科學基金委優秀青年基金項目和青年科學基金項目、中國科學技術協會青年人才托舉工程項目和中科院青年創新促進會等的經費支持。

圖1 AcrVA4與LbCas12-crRNA結合的復合體三維結構

圖2 AcrVA4抑制Cas12a活性的工作模型