微生物顯微鏡直接計數法

實驗概要

1．明確顯微鏡計數的原理。
2．學習使用血球計數板進行微生物計數的方法。

實驗原理

利用血球計數板在顯微鏡下直接計數，是一種常用的微生物計數方法。此法的優點是直觀、快速。將經過適當稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計數板載玻片與蓋玻片之間的計數室中，在顯微鏡下進行計數。由于計數室的容積是一定的（ 0．1mm2），所以可以根據在顯微鏡下觀察到的微生物數目來換算成單位體積內的微生物總數目。由于此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數法。

　　
血球計數板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個平臺。中間的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網，每個方格網共分九個大方格，中間的大方格即為計數室，微生物的計數就在計數室中進行。血球計數板構造如圖Ⅷ-1。

　　
計數室的刻度一般有兩種規格，一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格（圖Ⅷ-2）；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格（圖Ⅷ-1，C）。但無論是哪種規格的計數板，每一個大方格中的小方格數都是相同的，即16×25=400小方格，如圖Ⅷ-2。

　　
每一個大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0．1mm，所以計數室的容積為0．1mm3。

　　
在計數時，通常數五個中方格的總菌數，然后求得每個中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一個大方格中的總菌數，然后再換算成1ml菌液中的總菌數。

主要設備

血球計數板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細管；

實驗材料

釀酒酵母菌懸液

實驗步驟

1．稀釋

　　將釀酒酵母菌懸液進行適當稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。

　　
2．鏡檢計數室

　　在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進行計數。

　　
3．加樣品

　　將清潔干燥的血球計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的細口滴管將稀釋的釀酒酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多），讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自行進入計數室，一般計數室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產生。

　　
4．顯微鏡計數

　　靜止5分鐘后，將血球計數板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數。在計數前若發現菌液太濃或太稀，需重新調節稀釋度后再計數。一般樣品稀釋度要求每小格內約有5—10個菌體為宜。每個計數室選5個中格（可選4個角和中央的中格）中的菌體進行計數。位于格線上的菌體一般只數上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作兩個菌體計數。計數一個樣品要從兩個計數室中計得的值來計算樣品的含菌量。

　　
5．清洗血球計數板

　　使用完畢后，將血球計數板在水籠頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。