微生物生物量和生長曲線的測定

實驗原理

我們知道微生物都具有生長旺、繁殖快的特點，單細胞微生物如細菌、酵母菌的個體細胞的增大即細胞物質的增加是有限度的，細胞長大到 一定程度就開始分裂繁殖，菌體數量增多。細菌旺盛生長時幾十分鐘就可繁殖一代。
因此他們的生長往往是通過繁殖表現出來的，本質上是以群體細胞數目增加為生長標志。絲狀微生物如放線菌、霉菌的生長主要表現為菌絲的伸長和分枝，他們相互纏繞，很難分清個體與個體之間的界限，所以通常以菌絲的重量增長(細胞質量的增加)或菌絲生長速度間接來衡量生長狀況。目前測定微生物數量的方法有直接法和間接法。直接法包括血球計數板法、涂片染色法、比濁法等；間接法又包括平皿菌落計數法、液體稀釋法、薄膜過濾計數法等。測定細胞物質量的方法有定氮法測、DNA法、測定細胞干重法、測定細胞濕重法、生理指標測定法等。
為了學習微生物的生長規律，增進了解微生物生長旺、繁殖快的特點，以酵母、放線菌和黃瓜枯萎病菌作為實驗材料，本實驗采用了干/濕重法、血球計數法直接計數、比濁法以及菌絲長度測量法,測定了放線菌及黃瓜枯萎病菌的生長量和黃瓜枯萎病菌的生長曲線，繪制了酵母生長標準曲線（細胞數密度-OD420）。

實驗試劑

培養基： 牛肉膏蛋白胨液體培養基(肉湯培養液)  高氏一號培養基(液/固)  馬鈴薯蔗糖培養基(PDA液/固)
試劑： 無菌水

實驗設備

震蕩器 
血球計數板(0.10mm  1/400mm2  16×25)
電爐
恒溫培養搖床
普通離心機
超凈工作臺 
恒溫培養箱 
手提式高壓蒸汽滅菌鍋 
光學顯微鏡 
721型分光光度計 
比色皿 
布氏漏斗 
烘箱 
打孔器 
接種環 
定性濾紙 
直尺等

實驗材料

菌種：放線菌  釀酒酵母菌 黃瓜枯萎病菌

實驗步驟

1. 放線菌生物量測定

（1）菌絲的生物量測定——干/濕重法

將從土壤中分離出的放線菌在高氏1號平板上密集劃線后，培養一周。用打孔器打下數個菌塊，分別取3片菌塊放入3瓶50ml/250ml高氏1號液體培養基中，1片菌塊放入50ml/250ml無菌水中，30℃ 200rpm搖瓶培養一周后用定性濾紙過濾，收集菌絲，測出濕重后，將菌絲置于80℃烘箱中烘干至恒重，再測出的菌絲重量即為干重。

2. 黃瓜枯萎病菌生長量測定 

(1) 菌絲長度測量法

通過測定菌落生長的直徑來估測黃瓜枯萎病菌的生長速率。

挑一小塊帶黃瓜枯萎病菌菌絲的培養基接種于PDA平板中央，培養一周后用直徑0.8cm的無菌打孔器打下接種至直徑9.0cmPDA平板的中央，在接下來的一周內每隔12hours測量一次菌絲的生長長度，直到菌絲掩蓋全皿為止。求出菌絲的平均生長速率，并據此繪制出生長曲線。

(2) 菌絲的生物量測定——干/濕重法

將培養一周的黃瓜枯萎病菌PDA平板用打孔器打下數個菌塊，取3片菌塊分別放入3瓶50ml/250ml PDA液體培養基中，1片菌塊放入50ml/250ml無菌水中，30℃ 200rpm搖瓶培養一周后用定性濾紙過濾，收集菌絲，測出濕重后，將菌絲置于80℃烘箱中烘干至恒重，再測出的菌絲重量即為干重。   

3. 酵母生長量測定

(1) 測定酵母細胞懸浮液的OD值——比濁法

將酵母接種至肉湯培養液(50ml/250ml)中，每瓶接一環，共2瓶，28℃ 125rpm搖瓶培養兩周。將培養液分裝入10ml離心管中5000r/min離心5～6min，棄去上清，再用無菌水重懸，離心并棄去上清，重復2次，以除去殘留在培養液。

合并沉淀，用無菌水按一定比例稀釋為6個稀釋度，于420nm處測量OD值（721型分光光度計的有效測量范圍為0.1-0.65）。

(2) 測定酵母懸浮液的細胞濃度——血球計數板計數

洗凈血球計數板后將蓋玻片蓋在計數室上，用細口滴管將其中一個稀釋度的菌液來回吹吸數次，使菌液充分混勻后立即吸取少量菌液加在蓋玻片的邊緣上，讓菌液由蓋玻片與計數板的縫隙間滲入計數室(計數室內不能有氣泡)。輕壓蓋玻片，以免因菌液過多而將蓋玻片頂起而改變了計數室的容積。

靜置片刻，待菌體自然沉降穩定后，先用低倍鏡尋找計數室的位置(視野宜調暗些)，找到后將它移到視野中央，再換高倍鏡觀察和計數。計數完畢后，洗凈計數板。每個稀釋度計數一次。

計數原則：為了減少誤差，常取4個角上的4個中方格和中央的1個中方格計數，zui后取其平均值。另外：計上不計下，計左不計右，計數務必要有一定路徑。

根據OD值與酵母細胞血球計數值繪制標準曲線圖。

注意事項

微生物的生長繁殖是其內外各種環境因素相互作用下生理、代謝等狀態的綜合反映，因此，有關生長繁殖的數據就可以作為研究多種生理、生化和遺傳等問題的重要指標；同時，微生物在生產實踐上的各種應用或人類對致病、霉腐等有害微生物的防治，也都與它們的生長繁殖或抑制緊密相關。
本實驗方法有其顯著的優點，也有一些不足之處：
1. 血球計數板是一種常用的微生物直接技術方法，具有直觀快速、容易操作等優點，但費力，傷眼睛，且對菌懸液濃度要求高，一般不宜過低或過高(常大于10~6個/ｍ），OD值應在0.1-0.65之間，不易把握。而且此法不能測出活菌數，若選用臺酚藍等染色液,可使死細胞染為藍色,活細胞不被染色，從而測出活菌數。
2. 濕重法和干重法可以體現發酵液中生物質的多少,但不能反映菌絲生理狀態,衰老程度,甚至不能區分細胞死活。
3．對輻射生長的絲狀真菌進行菌絲生長速率法衡量其生長狀況來的簡捷、方便，但似乎應用性不強。
因此，每種方法都各有優點和局限性，只有在考慮了這些因素同需要著手解決的問題之間的關系以后，才能選擇較優者，或者幾種方法同時并用。