微生物細胞的大小是微生物重要的形態特征之一,由于菌體微小,只能在顯微鏡下測量。用于測量微生物細胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。
目鏡測微尺(圖示)是一塊圓形玻片,在玻片中央把5mm長度刻成50等分,或把10mm長度刻成100等分。測量時,將其放在接目鏡中的隔板上,此處正好與物鏡放大的中間物像重迭,用于測量經顯微鏡放大后的細胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數不相同,目鏡測微尺每格實際表示的長度也不一樣,因此目鏡測微尺測量微生物大小時須先用置于鏡臺上的鏡臺測微尺校正,以求出在一定放大倍數下,目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。鏡臺測微尺(圖示)是中央部分刻有精確等分線的專用載玻片,一般將1mm等分為100格,每格長10μm即0.01mm,是專門用來校正目鏡測微尺的。校正時,將鏡臺測微尺放在載物臺上,由于鏡臺測微尺與細胞標本是處于同一位置,都要經過物鏡和目鏡的兩次放大成像進入視野,即鏡臺測微尺隨著顯微鏡總放大倍數的放大而放大,因此從鏡臺測微尺上得到的讀數就是細胞的真實大小,所以用鏡臺測微尺的已知長度在一定放大倍數下校正目鏡測微尺,即可求出目鏡測微尺每格所代表的實際長度,然后移去鏡臺測微尺,換上待測標本片,用校正好的目鏡測微尺在同樣放大倍數下測量微生物細胞大小。
測定微生物細胞數量的方法很多,通常采用的有顯微鏡直接計數法和稀釋平板計數法。
直接計數法適用于各種單細胞菌體的純培養懸浮液,如有雜菌或雜質,則難于直接測定。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數板,一般細菌則采用彼德羅夫·霍澤(Petrof Hausser)細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同,只是細菌計數板較薄,可以使用油鏡觀察。而血球計數板較厚,不能使用油鏡,計數板下部的細菌難于區分。
血球計數板是一塊特制的厚型載玻片,載坡片上有4條槽所構成的3個平臺。中間的平臺較寬,其中間又被一短橫槽分隔成兩半,每個半邊上面各有一個計數區(圖示),計數區的刻度有兩種:一種是計數區分為16個大方格,大方格用三線隔開,而每個大方格又分成25個小方格;另一種是一個計數區分成25個大方格,大方格之間用雙線分開,而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數區是哪一種構造,它們都有一個共同特點,即計數區都由400個小方格組成(圖示)。
計數區邊長為1mm,則計數區的面積為1mm2,每個小方格的面積為1/400 mm2。蓋上蓋玻片后,
計數區的高度為0.1mm,所以計數區的體積為0.1mm3,每個小方格的體積為1/4000 mm3。
使用血球計數板計數時,先要測定每個小方格中微生物的數量,再換算成每mL菌液(或每g樣品)中微生物細胞的數量。
已知:1mL體積=10 mm×10 mm×10 mm=1000mm3
所以:1mL體職應含有小方格數為1000mm3/(1/4000mm3)=4×106個小方格,即系數K=4×106。
因此:每mL菌懸液中含有細胞數=每個小格中細胞平均數(N)×系數(K)×菌液稀釋倍數(d)。