微生物酯酶的分離純化技術及應用

酯酶，又稱羧酸酯酶，是一類能夠對羧酸酯酯鍵作用的水解酶，可在水分子的參與下，經由水解作用，將酯類切割成酸類與醇類。酯酶普遍存在于動物、植物和微生物中，在水分子的參與下能夠催化裂解酯鍵形成相應的醇和酸。微生物酯酶作為生物催化劑，具有很高的催化功能、底物特異性和反應特異性，利用其水解反應、酯轉換以及酯合成反應廣泛應用于食品、化工、環保等領域。在自然界中能產生酯酶的微生物資源是非常豐富的，主要來源是真菌，真菌中主要是青霉、鐮孢霉、紅曲霉、黑曲霉、黃曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、犁頭霉、須霉、白地霉和核盤菌等l2屬，其次是細菌，細菌主要是假單胞菌、粘質賽氏桿菌、無色桿菌和葡萄球菌等。另外，放線菌中的個別種類也能產生一定量的酯酶。

　　對于微生物的胞外酯酶，發酵液經離心或過濾去除細胞，將上清液用超濾、鹽析或有機溶劑沉淀等方法濃縮粗提；胞內酯酶則需進行細胞破碎再分離，大多數采用鹽析或有機溶劑沉淀的方法進行粗提，為了獲得更高的純度，再用凝膠過濾或親和層析等方法進行細分離。

　　1. 微生物酯酶的常規分離純化技術

　　1.1超濾 超濾是利用壓力或離心力，使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜而使大分子溶質不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質得到了部分的純化，根據蛋白質分子大小的不同而選擇不同分子量的膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的，從而使蛋白質得到分離。

　　1.2鹽析法

　　鹽析一般是指溶液中加入無機鹽類，蛋白質在低鹽濃度下的溶解度隨著鹽溶液濃度升高而增加，當鹽濃度不斷上升時，蛋白質的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此稱鹽析，從而達到分離純化的效果。一般粗抽提物常用該法進行粗分。

　　1.3 有機溶劑沉淀法

　　利用不同蛋白質在不同濃度的有機溶劑中的溶解度差異而分離的方法即為有機溶劑沉淀法。有機溶劑能降低溶液的介電常數，削弱溶劑分子與蛋白分子間的作用力，從而增加蛋白質分子上帶電粒子的相互吸引力，致使蛋白分子聚合沉淀；另有機溶劑溶解于水的同時，能從蛋白質周圍的水化層中奪走水分子，破壞水化層，從而使蛋白質沉淀析出。

　　1.4凝膠層析

　　混合物隨流動相流經裝有凝膠作為固定相的層析柱時，溶液中各物質因分子大小不同而被分離，在洗脫過程中，分子質量最大的物質因不能進入凝膠網孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，分子量最小的物質能進入凝膠網孔而受阻滯，流速緩慢，致使最后流出柱外。凝膠層析是一種快速而簡便的分離分析技術，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，并且對分離成分理化性質的保持有獨到之處，對于高分子物質有很好的分離效果。因此被生物化學、分子生物學、生物工程以及醫藥學等領域廣泛應用。陳寧等利用Sephadex G-25凝膠層析柱和反相柱對核桃蛋白酶解物，獲得抗氧化能力最強的多肽序列Ala-Gly-Gly-Ala。張志強等， 采用硫酸鈉鹽析法與凝膠層析法對卵黃進一步純化，得到純度為97%的IgY。

　　1.5親和層析

　　蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質被吸附而滯留在層析柱中，沒有親和力的蛋白質不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質分開，然后選用適當的洗脫液，改變結合條件將被結合的蛋白質洗脫下來，從而達到分離提純的目的，這種分離純化蛋白質的方法稱為親和層析。

　　2 新穎的分離純化技術

　　2.1 膜處理技術

　　微生物發酵液以橫過膜表面的方式通過錯流膜，液流清掃膜表面的溶質層，使溶質無法積聚在膜表面處，從而截留微生物細胞和濃縮含酶發酵液，從而達到分離純化的目的。Sztajer等用毛細管超濾膜純化Pseudomonas fluorescens脂肪酶，他們比較了2種毛細管超濾膜：內徑1.1mm截斷相對分子質量為10kDa的聚丙烯腈和聚砜。對PS而言，僅觀察到濃縮效果，適合濃縮酶；而PAN除了濃縮，還除去雜蛋白可應用于初分離。

　　2.2 免疫親和純化技術

　　免疫親和純化技術是一種高效選擇性的蛋白質純化技術。通過一步純化，純化倍數可達1 000-10 000。免疫純化技術大部分是應用單克隆抗體和多克隆抗體，選擇性依賴于單克隆抗體對目標蛋白的特異性程度及對雜蛋白的影響。免疫親和純化具有以下特點：①抗體與其相應抗原結合具有高度親和力和特異性，能大量分離天然狀態或近似天然狀態的抗原；②不是所有的抗體都適用于免疫親和純化，但一旦獲得一種性能良好的抗體，純化過程就很快速而且可靠；③可按照不同規模進行，半天內即可完成，而且可以獲得其他層析法不可比擬的純化效果；④經過簡單的改進，免疫親和法也可用于純化針對不同抗原的特異性抗體。Bandmann等在所有突變體的N末端引入IgG結合位點，構建融合蛋白，利用IgG與靶位點特異性結合的免疫方法純化了E. coli表達的脂肪酶突變體角質酶。

　　2.3 反膠束萃取技術

　　反膠束萃取是指當有機溶劑中加入的表面活性劑濃度超過其臨界值時，表面活性劑在溶液中形成反膠束，非極性基團在外，極性基團則排列在內，形成一個極性核，此極性核具有溶解極性物質的能力，當含有此種反膠束的有機溶劑與蛋白的水溶液接觸后，蛋白及其他親水性的物質能夠溶于極性核內部的水中，由于周圍的水層和極性基團的保護，蛋白不與有機溶劑接觸，從而不會造成失活，實現對蛋白質的萃取。

　　目前用于反膠束萃取常用的有機溶劑是異辛烷，反膠束萃取的表面活性劑主要是陰離子丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉和陽離子表面活性劑氯化三辛基甲基銨。為了進一步提高反膠束萃取分離的選擇性，可在反膠束表面活性劑的烷基上連接對蛋白質具有生物專一性的配基，實現反膠束親和萃取分離。

　　3 微生物酯酶的應用研究

　　微生物酯酶是一種重要的工業酶類，涉及到酯合成、內酯合成、酯交換、多肽合成等催化反應，酯酶催化不需要輔酶且具有反應條件溫和、方法簡便、催化活性高、選擇性強、產物易于分離、易于回收等優點，因此廣泛應用于食品、化工、環保等領域。

　　在食品加工過程中，微生物嗜熱酯酶的使用，可以減少食品的脂肪水解、蛋白質消化、纖維素水解等過程在常溫下用傳統酶作用造成的食品污染，同時可以將水解、消化過程與烹制相結合減少工序。

　　微生物酯酶還可以應用于啤酒、曲酒的風味改進。啤酒在來自于酵母菌的酯酶和乙酰轉移酶的共同作用下，產生醋酸異戊酯，可以大大改進啤酒的風味。利用微生物酯酶在濃香型曲酒的增香技術方面還不是十全十美，有不少技術還需要進行探討、完善。國內有許多報導，在食醋和醬油的釀造中可以利用微生物酯酶催化產生的酯類來增進香味。

　　微生物酯酶是一類具有很高的催化功能、底物特異性和反應特異性的生物催化劑，利用其酯轉換反應及酯合成反應能制備大量有價值的日用化工品，反應且不需要輔酶。如黑曲酯酶在有機溶劑中發生縮聚反應，形成二醇和酸相間的三聚及五聚體；微生物酯酶還廣泛應用于其他的工業企業，如來源于Ophiostoma piceae的固醇酯酶已經應用于造紙業，它不但能夠水解固醇酯類，對甘油三酯也有很好的降解作用；來源于假單胞菌、色素桿菌以及皺褶念珠菌的固醇酯酶和膽固醇酯酶，在增加紙張致密度方面起著重要作用。

　　酯酶的應用研究也為一些國家的環境及軍事部門所重視。土壤中存在分泌磷酯和氨基甲酸酯結構水解酶的微生物，其分泌物水解酶能夠使有機磷酸酯和氨基甲酸酯類農藥在土壤中較易分解。這些降解酶比產生這類酶的微生物菌體更能忍受異常環境條件，并且酶的降解效果遠勝過微生物本身。因此，人們設想利用降解酶作為凈化農藥污染的有效手段，有關農藥降解酶的研究受到廣泛關注。Derbyshire等[33]從無色桿菌 Achromobacter sp. 提取呋喃丹酯鍵水解酶，純化后的水解酶對低濃度的呋喃丹和西維因有較好的降解效果。

　　4 結論

　　目前，除上述技術外，微生物酯酶的分離純化技術還有很多，如移動界面電泳，離子交換層析，HPLC法等都是有效的分離純化方法，但還要根據具體的實驗要求，設計和選擇最適合的純化方法才能達到最優的純化效果。同時微生物酯酶的研究已經進行到分子層面，并且隨著人們生活水平的提高，食品、化妝品等中添加天然成分逐漸受到廣泛關注，因此，微生物酯酶在食品、日用化工等領域具有廣泛的應用前景。