志賀氏菌核酸檢測試劑盒（恒溫熒光法）使用說明

◆ 產品說明

致病菌檢測系列基于獨特的恒溫熒光檢測技術，可針對食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進行擴增，儀器實時監測擴增過程中的熒光信號變化，自動判讀結果。本產品用于志賀氏菌的檢測。檢出限為10³ CFU/ml。  

◆ 產品組成（48測試）

◆ 適用儀器

Dhelix 1610、Dhelix 3210、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308c等恒溫熒光檢測儀， ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等熒光PCR儀。

◆ 自備耗材和儀器

①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②滅菌0.2mL PCR管或八聯管；③冰盒；④移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；⑤離心機；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴

◆ 注意事項

1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。

1）第一區：試劑準備區。

2）第二區：樣本制備區。

3）第三區：模板添加區。

4）第四區：擴增及產物分析區。

★ 分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。

3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。

5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。

7. 檢出限為10³ CFU/ml是以1 ml 10³ CFU/ml增菌液離心后收集菌體再提取的細菌基因組DNA作為模板。

◆ 樣品處理

參照《GB 4789.5-2012 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 志賀氏菌檢驗》中的5.1處理樣品，對樣品進行前增菌，制備的菌液保存待用。

以無菌操作取檢樣25 g（ml），加入裝有滅菌225 ml志賀氏菌增菌肉湯的均質杯，用旋轉刀片式均質器以8000 rpm/min～10000 rpm/min均質；或加入裝有225 ml志賀氏菌增菌肉湯的均質袋中，用拍擊式均質器連續均質1 min～2 min，液體樣品振蕩混勻即可。于41.5 ℃±1℃，厭氧培養16 h～20 h。

詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。

◆ 實驗操作

將試劑完全解凍，各組分離心30s。

1. 試劑配制（試劑準備區，放置于冰盒中進行）：

若有N個待檢樣品，則參照下表，按照N+2個數量計算各組分用量（N個待檢樣品+1個陰性對照+1個陽性對照），將反應液置于0.6ml或者1.5ml離心管中，渦旋混勻，離心30秒，分裝于0.2ml PCR管中，并向每管加入1滴C-I（約20μl）。

1. 模板制備（樣本制備區）

建議使用試劑配套細菌組DNA提取系列產品，具體過程詳見產品說明書。

2.添加模板（模板添加區，放置于冰盒中進行）

在步驟1中已含有反應液的PCR管中加入2μL模板，順序為NG-I、待測樣品模板、PG-Shi-I。渦旋混勻30s，離心1min，立即進行擴增反應。

3.擴增反應（擴增及產物分析區）

①恒溫儀器63℃條件下反應30 min。

②若使用熒光定量PCR儀，則熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇None，將63℃ 15 s，63℃ 45 s作為一個循環，于63℃ 45 s處收集熒光信號，30個循環。 

其他儀器請參照儀器說明書進行設置。

◆ 結果判定

①儀器自動判定結果，若顯示“陽性”，則樣品中含有志賀氏菌；若顯示“陰性”，則樣品中不含有志賀氏菌或含量低于檢測限。

②在熒光定量PCR儀上，根據有無“S”型擴增曲線判定結果。若有“S”型擴增曲線，則樣品中含有志賀氏菌；若無“S”型擴增曲線，則樣品中不含有志賀氏菌或含量低于檢測限。

NG反應管結果顯示“陰性”，PG反應管結果顯示“陽性”，此次檢測結果有效，否則無效。