急性白血病的“照妖鏡”？流式細胞術來幫你

流式細胞術（FCM）是一門綜合性的細胞分析和分選技術，綜合了光學、電子學、細胞化學、流體力學、細胞免疫學、激光和計算機等多門學科和技術。應用流式細胞儀，可以快速測定單個細胞的熒光、光散射或光吸收等生物學性質，定量反映細胞大小、膜受體和表面抗原等許多重要參數。本文主要介紹在急性白血病（AL）診斷中的應用。

FCM的原理

利用偶聯了熒光染料的單克隆抗體對樣本進行標記，抗原抗體特異性結合后，在流式細胞儀中經過鞘液包裹形成單細胞流，依次經過激光發射器，分別獲取到直射光信號（入射光和出射光成0°）和散射光信號（入射光和出射光成90°），前者包括前向散射光（FSC），后者包括側向散射光（SSC）以及熒光信號（如FL1信號），不同的光信號經過光電轉換系統最終呈現到計算機上供技術人員分析。

如何識別白血病細胞？

對于抗原的表達與否，其中一種判定方式就是內對照。利用CD45/SSC兩個參數可以把細胞群大致分為淋巴細胞、B祖細胞、單核細胞、粒細胞、原始細胞、有核紅細胞（圖1）。不同的細胞抗原表達情況不同，因此每一幅圖都存在天然的陰性對照和陽性對照群。如圖2綠色和紅色群就是天然存在的CD3的陰陽性對照。

圖1 骨髓樣本的CD45/SSC

圖2 淋巴細胞群的CD3/CD8

AL的特點就是骨髓原始細胞惡性增殖，比例增高（WHO標準≥20%），其他各群受抑制。在CD45/SSC上，原始細胞區域細胞明顯增多。正常細胞在不同階段抗原表達都具有一定的規律，并且這些規律穩定可重復（如圖3所示）。而白血病細胞的特點是惡性克隆，這種規律是紊亂的。這些異常的表型即白血病相關表型（LAIP），形式包括正常抗原表達量的增加或減少、抗原表達不同步、系列交叉表達、抗原表達集中或均一（單克隆）。

圖3  粒系、單核及T系部分抗原的表達規律

根據異常細胞類型（見表1）的不同AL分為急性髓系白血病（AML）、急性淋巴細胞白血病（ALL）以及特殊類型白血病，特殊類型白血病又包括混合細胞白血病（MPAL）、急性未分化細胞白血病（AUL）、急性白血病不能分類。

表1  各系列鑒別標志

按照WHO分類AML包括AML伴重現性遺傳學異常、AML伴骨髓增生異常相關改變、AML-NOS等。本文只討論AML-NOS，AML-NOS包括AML-M0~M7，各亞型惡性增殖細胞不同。

AML-M0為階段最早的髓系原始細胞，流式表型顯示非常原始，髓系相關抗原表達較少。

AML-M1、M2主要為原始粒細胞，相比M0表達髓系標志多一些。

AML-M3是異常早幼粒細胞，此亞型在治療上利用維甲酸及砷劑誘導分化可以獲得很好的預后，但是早期臨床癥狀比較兇險，容易出現彌散性血管內凝血（DIC），因此早期準確診斷對患者預后很重要。

AML-M4典型表現為存在兩類異質性細胞，其中一類具有原始粒細胞表型特點，另一類表現為幼稚單核細胞表型。

AML-M5為原始單核和或幼稚單核，若部分原始單核細胞未表達出單核相關表型，則難以與AML-M1區分，這時候需要綜合細胞形態學以及細胞化學。

AML-M6是紅系發生惡性增殖，表現為病態紅系增生，原始細胞表達紅系特異性標志CD235a。

AML-M7比較少見，主要是巨核細胞發生惡性增殖，原始細胞表達巨核特異性標志CD41、CD42b、CD61。根據上述特點，可以對AML亞型做出提示（表2）。

表2  AML-NOS各亞型表型特點

ALL根據表型分為T-ALL、B-ALL，而且可以在這個基礎上區分所處的階段。B-ALL表型主要為強表達CD19、CD10 ，CD20陰性或者弱陽，CD34、TDT多陽性，CD58表達增強，CD38表達減弱；根據CD10、cμ的表達與否分為pro-B-ALL、Common -BALL、pre-B-ALL（表3）。T-ALL中 CD34、TDT、CD38、CD99多為陽性，表達CD7、cCD3；根據CD1a、CD2、CD4、CD8的表達與否分為Pro-T、Pre-T、皮質T和髓質T（表4）。

表3  急性B淋巴細胞分類

表4  急性T淋巴細胞分類

特殊類型的急性白血病發病率極低，占AL患者的不到1%。對于MPAL，如果存在兩類異質性細胞，則分別按照表1判斷是髓系、B系或T系；若只有一類細胞，則要判斷是否達到各系的標準（表5），根據表達情況可分為M/T、M/B、T/B，以及最少見的M/B/T。AUL原始細胞無髓系分化的形態學特征，細胞化學髓過氧化酶和非特異性酯酶陰性；表達不多于一個任何已知系別的膜表面標志，不表達淋系或髓系特異性抗原。急性白血病不能分類可以表達數種標志，但是卻難以歸為單一系別，也不符合AUL及MPAL。

表5  MPAL判斷標準（WHO）

相比其他技術的優勢

在FCM普及以前，AL的診斷方法主要是細胞形態學和細胞化學，準確性依賴閱片人員的經驗，相對來說比較主觀；且難以區分系列，尤其T系和B系的區分。

傳統的FAB分類根據細胞大小，將ALL分為L1、L2、L3三類；但是這三類中既有T-ALL，也有B-ALL，甚至后來ALL-L3被發現是一類特殊的疾病（伯基特淋巴瘤）。FCM的優勢在于客觀，準確、快速。分析過程在單細胞水平進行，分別檢測其形態、大小、熒光特征及抗原表達，對AL進行客觀而又準確的診斷。特殊類型的急性白血病更是在診斷標準上要依賴于FCM。

因此在MICM分型中，即白血病形態學（morphology）、免疫學（immunology）、細胞遺傳學（cytogenetics）、分子生物學（immunology），免疫學是重中之重。FCM分析速度也很快，可達到5000~10000個/秒，最新的流式細胞儀可以達到30000個/秒以上。另外FCM可檢測樣本種類也較多，包括骨髓、外周血、腦脊液、胸腹水及皮膚組織、淋巴結等，因此FCM對于AL的髓外浸潤同樣也可作出診斷。

FCM也具有很高的敏感性，在獲取50萬個細胞基礎上，敏感性能到達10-4，獲取細胞數更多的情況下，敏感性能達到與PCR同級別，而且實驗過程更加快速，設施不需要PCR那么嚴格。另外PCR以及細胞遺傳學對于AL的診斷限于存在特定分子學改變的病例，應用范圍受到影響。而FCM不存在這個問題，在此基礎上還具有目的細胞群的分選功能。

FCM的缺點

對于任何一種檢測手段，都會有它的局限，FCM同樣也不除外，由于樣本需要前處理（裂紅、離心），不可避免的會造成部分細胞的丟失、損耗。在AML-NOS中，部分情況下區分粒系和單核系有困難，不過這個問題可以通過未來新標志的發現得到解決。最后FCM還需要分析人員具有豐富的經驗，人員培訓周期長。

結語

各種技術手段的出現讓以前難以診斷的疾病得到的診斷，從而提高治療效果，改善病人的預后。對于醫務工作者來說這些手段就是“照妖鏡”。但是疾病的診斷從來不是單純依靠某一門技術或者檢測手段得到解決的，它們有各自的長處、缺點，因此需要綜合各學科，揚長避短。而且“照妖鏡”之所以厲害是因為使用它的人，而不是它本身，因此也需要不斷學習進步。