總細胞RNA的提取方法

實驗概要

總細胞RNA的提取在建庫過程中，由于cDNA合成這一步將使用通用引物oligo dT，因此在總RNA提取這一步中，提取純化mRNA不是非常必要的。提取高純度的總細胞RNA足可以被用作cDNA合成的模板，目前提取RNA的方法很多，也有不少商業化的試劑盒。

實驗步驟

1. TRIZOL法

   1) 在制備的帶有細胞沉淀的Eppendorf管中加入1ml TRIZOL溶液，用手反復搖勻至細胞碎塊完全被裂解，如不易完全裂解，可用移液器帶有1ml無菌吸頭反復吹打、研磨，至組織細胞完全裂解，液體基本澄清為止，必要情況下，可再次加入少許TRIZOL溶液。

   2) 將上述Eppendorf管置室溫(25~27℃)靜置15~20min后(也可置4℃較長時間)，每管加入0.2ml氯仿(0.2ml/ml)，在手中反復振蕩搖勻，室溫靜置10min。

   3) 將Eppendorf管置于高速臺式冷凍離心機，或將普通離心機事先置4℃冰箱預冷。在4℃ 12 000r/min離心10min。

   4) 小心吸取上層水相置于另一無菌的新的Eppendorf管中，內含有提取的細胞總RNA。

   5) 于管中加入0.5ml異丙醇，室溫沉淀10min或4℃沉淀30min至1h。

   6) 4℃ 12 000r/min離心10min，棄上清，沉淀用75%無水乙醇洗兩次。

   7) 最后讓沉淀的RNA在室溫自然干燥，切勿抽干。

   8) 每管用8~10μl無RNAase的純水重懸干燥后的RNA，置于冰浴立即用于cDNA合成或置-70℃長期保存。

2. 標準RNA分離試劑盒(standard RNA isolation Kit)法

   1) 在變性的異硫氫酸胍(guanidinium isothiocyonate)溶液中(溶液D)加入0.1ml二巰基乙醇最終至14ml變性溶液。

   2) 加入1ml溶液D至Eppendorf管中沉淀細胞(約10⁷細胞)，懸起沉淀，使細胞碎片裂解。

   3) 加入0.1ml 2mol/L pH值4.0醋酸鈉，混勻，分成兩小管。

   4) 每管中加入0.5ml水飽和酚，充分混勻。

   5) 每管加入1ml氯仿異戊醇溶液，混勻10s。置冰浴15min，如果未形成兩層，另加入0.5~1ml氯仿異戊醇溶液。

   6) 置4℃，12 000r/min離心至少20min。

   7) 將上層水相轉移至一新鮮Eppendorf管中，加等量異丙醇，置-20℃沉淀1h。

   8) 12 000r/min 4℃離心20min，沉淀RNA。

   9) 重懸RNA沉淀于0.5ml溶液D中。

   10) 加05ml異丙醇混合搖勻，存放-20℃備用。

   11) 臨用前12 000r/min 4℃離心沉淀，用75%乙醇洗一次。

   12) 室溫自然干燥沉淀的RNA，切勿過于干燥。

   13) 重懸于50μl無RNA酶的純水中。

   14) 檢測RNA純度和濃度：260/280nm吸收濃度比值需1.8。如果比值過低，表明有蛋白質或酚污染。RNA濃度(μg/ml)=260nm吸收值×稀釋度×40。

一般免疫后的鼠脾臟，可獲總量30~50μg RNA，人外圍血則少些，RNA總量約為20~30μg/50ml外周血。