總裁專訪|單細胞蛋白質組分析成為現實

　　多組學發展的兩大趨勢是大隊列高通量分析和單細胞多組學高靈敏度分析。近年來單細胞測序的基因組學成為熱點，而蛋白無法如基因般擴增，單細胞蛋白質組學更具挑戰。去年Matthias Mann教授團隊首次展示了單細胞蛋白質組學的成果，布魯克今年就為科學家們推出了timsTOF SCP質譜，同時推出在大隊列高通量分析方面已好評如潮的二代機型timsTOF Pro 2。

　　布魯克于2021年6月1-3日舉行了主題為“拓展單細胞研究視野”的eXceed全球網絡研討會，重磅發布了新產品—— timsTOF Pro 2 和 timsTOF SCP。借此契機，布魯克生命科學質譜副總裁Rohan A. Thakur博士接受了分析測試百科網的采訪，就布魯克質譜的產品和未來發展趨勢進行了介紹。

布魯克生命科學質譜副總裁

Rohan A.Thakur 博士

　　timsTOF Pro 2 蛋白質組學分析新主力

　　timsTOF Pro 2是蛋白質組學分析的新主力，適用于血漿、組織樣本和細胞培養的高穩定、無偏、高深度和定量4D-蛋白質組學和4D-表型蛋白質組學研究。它將基因組學、蛋白質組學與表型蛋白質組學相結合，支持液體、活檢多組學生物標記物研究。該技術進一步與優化的dda-PASEF、dia-PASEF和prm-PASEF方法相結合，提供行業領先的性能以及無與倫比的高穩定性和高通量。對200ng的HeLa酶解液進行60分鐘梯度分析，timsTOF Pro 2采用dda-PASEF的方法可鑒定超過6,000個蛋白和60,000個特異性肽段；對20ng的HeLa酶解液進行30分鐘梯度的采集，可以鑒定超過4,000個蛋白和30,000個特異性肽段，實現高覆蓋率蛋白分析。

圖：布魯克 timsTOF Pro 2 質譜儀

　　我們的用戶德國美因茨大學醫學中心免疫學研究所的Stefan Tenzer教授展示的數據顯示，timsTOF Pro 2可以從起始材料僅有150ug的蛋白質中鑒定27,768條特異性磷酸化肽段。另一特別亮點在于，通過TIMS和PASEF組合，在1946個已確定的共洗脫異構體中，20%可以完全用TIMS分離，該研究成功分離了457種共洗脫的磷酸化修飾位置異構體。

圖：Stefan Tenzer教授：150ug蛋白質中鑒定27,768條特異性磷酸化肽段，利用TIMS在1946個磷酸化異構體中分離457個。Tenzer教授表示：“除了高靈敏度之外，TIMS技術的一個獨特方面是它能夠通過離子淌度來解析氣相中的磷酸化位置異構體，對信號通路提供更詳細的信息。”

　　timsTOF SCP 單細胞蛋白質組研究利器

　　timsTOF SCP展現了在靈敏度方面的革命性提升，可開展單細胞蛋白質組學研究。團隊正在擴展單細胞研究的視野，在世界上首次讓研究者運用基于質譜的單細胞蛋白質組學方法，研究細胞周期，觀察包括翻譯后修飾的表型蛋白質組。timsTOF SCP通過無偏、深度單細胞 4D-蛋白質組學為scRNA測序提供補充，徹底革新了定量單細胞生物學研究。德國馬克斯·普朗克生物化學研究所Matthias Mann等人的論文中，突破性地在單細胞中鑒定并定量了1,400多種蛋白質。

　　timsTOF SCP正是布魯克與Matthias Mann團隊的合作成果，同時與Evosep公司在~100nL/min的超低流速平臺上共同開發了新的Whisper方法。timsTOF SCP在數據非依賴性采集dia-PASEF或平行反應監測PRM-PASEF方法中，提高了五倍的離子傳輸率。dia-PASEF方法與帶有Whisper的Evosep One LC平臺相結合，進行了數百個單細胞蛋白質組學分析，證明了真實、無偏4D-蛋白質組學用于單細胞的分析的出色性能，每個細胞可定量約1,500個蛋白質。timsTOF SCP具有超高靈敏度，可進行無偏單細胞（對單個或幾個細胞進行激光捕獲顯微切割）蛋白質組學研究，其超高靈敏度也可應用于免疫腫瘤學研究領域中，免疫肽組學的新抗原發現。同時timsTOF SCP可將單細胞生物學應用范圍從基因組學和轉錄組學，成功擴展到無偏、定量4D-蛋白質組學。

　　Rohan進一步介紹說，單細胞研究的主要挑戰來源于樣品制備，如何從單個細胞中提取物質，如何減少樣品制備的損失是我們最關注的問題。布魯克同第三方合作，包括細胞分選和分離的專家，利用流式細胞熒光分選技術（FACS）選擇單個HeLa細胞并進行單細胞蛋白質酶解。在樣品制備后，布魯克與Evosep公司密切合作，使用Whisper?技術的納流方法，其流速約75-100納升/分鐘，這種極低的流速可最大幅度地提高質譜分析的靈敏度，獲得3秒或更短時間的色譜峰。由于單細胞蛋白質組學研究的最大挑戰源于樣本制備和分離，timsTOF SCP結合FACS分離和樣本制備技術，Evosep的Whisper技術，首次實現了商品化的單細胞蛋白質組學分析。

圖：timsTOF SCP 系統實現單細胞4D-蛋白質組學分析

　　其它新產品

　　在生物信息學方面，布魯克去年收購IP2公司并于HUPO會議期間推出PaSER，這是第一款基于GPU強大數據處理功能的搜索引擎軟件。PaSER適用于翻譯蛋白質組學，其涉及到很多運算并產生的文件格式較大。當用戶搜索數據庫時，這些生成的大量數據集將遇到假陽率等諸多問題。PaSER致力于減少搜庫時間，提高數據分析的效率。

　　今年推出的用于4D-蛋白質組學分析的PaSER新版本有三大優勢：首先，提供MOMA瀏覽器，可觀測mobility offset mass aligned events，通過大規模CCS（碰撞截面積）值來表征色譜共流出物或異構體肽段。基于GPU搜索的研究已經擴展到免疫蛋白質組學領域。其次，與Peaks公司在從頭測序（de novo）展開合作，通過與Tony Purcell教授和Bioinformatics Solutions公司合作，真正實現了實時de novo測序，為新抗原發現提供了新途徑。Tony Purcell教授將推出其使用CCS的從頭測序軟件包。第三點，PaSER整合了支持CCS值的全新數據庫搜索的新算法——TIMScore?，該算法與John Yates教授共同開發，由機器學習驅動，可幫助研究者在極痕量水平上鑒定多肽并減少鑒定的模糊性（ambiguity）。TIMScore為第一個支持CCS數據庫的搜索算法，并增加了蛋白質和肽段的鑒定量，并同時保持了FDR控制和實時搜索速度。

圖：PaSER：基于GPU強大數據處理功能的搜索引擎軟件

　　6月21日，布魯克為timsTOF家族和impact II質譜推出加熱的電噴霧離子源，并推出代謝組學選項，這是MetaboScape的新版本，將使用戶擁有4D-代謝組學研究的新功能。

　　MALDI-2的反饋

　　去年，布魯克推出了世界上第一個商用MALDI后電離（PI）離子源MALDI-2，Rohan介紹了該產品的應用反饋。這是近30年來MALDI電離領域具有里程碑意義的創新。當前大多數的應用都在制藥領域，人們想研究小分子代謝物，開展更高層次的研究，希望“看到”小分子和組織，特別是在組織代謝層面。MALDI-2的進展如此之快，令人驚訝。

　　由于很多制藥公司不愿公開展示他們的數據，Rohan僅介紹了Ron Heeren博士的演講，他是荷蘭馬斯特里赫特大學質譜成像中心的主任。Ron Heeren博士介紹其在timsTOF fleX上使用MALDI-2所做的工作，在提高的靈敏度下，可以5-10mm的空間分辨率獲得單細胞分子成像圖譜。MALDI引導的空間定位組學（SpatialOMx）工作流程，幫助研究者在MALDI 圖像中識別特定細胞表型的區域，再使用激光顯微切割(LMD)收集這些區域，以便在同一 timsTOF fleX儀器中開展4D-蛋白質組學研究。雖然不便公開銷售數字，Rohan表示，許多制藥公司和研究者想擁有這項技術，在中國也已售出多套MALDI-2系統，第一套的用戶是香港浸會大學。

　　發布timsTOF Pro以來取得的成果

　　Rohan接下來介紹了自從發布timsTOF Pro以來取得的大量成果。

　　首先，timsTOF Pro最大的優勢在于讓蛋白質組學的轉化成為現實。由于其展現出驚人的穩健性和分析性能，當研究者面對如大量病人等特別多樣本時，他們更喜歡使用timsTOF Pro。例如，牛津大學納菲爾德分校醫學院的Roman Fischer教授26個月幾乎不停機地使用timsTOF Pro，連續運行了超過25,000 個 LC/MS 樣品，其中大約 5,000 個是未去高峰度蛋白（Non-depleted）的血漿樣本。

圖：Roman Fischer教授：從2019年2月使用timsTOF Pro開始，幾乎不停機地運行了超過25,000個樣本，其中5,000個是未去高峰度蛋白的血漿樣本

　　第二點，timsTOF Pro可深入研究表型蛋白質組學（epiproteome），它揭示重要的蛋白質翻譯后修飾（PTM），PTM在許多細胞過程中起著關鍵作用，如信號傳導和調節、蛋白質相互作用、細胞功能和定位等。德國美因茨大學醫學中心免疫學研究所Stefan Tenzer教授展示的數據表示，利用timsTOF Pro不僅可以鑒定特異性磷酸化肽段，還可通過TIMS和PASEF組合分離共洗脫的磷酸化修飾位置異構體。

　　Rohan小結道：timsTOF Pro 2具有高穩健性可運行大量的生物樣本，并能實時觀測翻譯后修飾的結果。當使用PASEF研究免疫多肽組時，可獲得高靈敏度并進行實時denovo測序，該能力已成為timsTOF Pro儀器最具吸引力的方面，同時人們正在利用CCS的優勢，對脂類或其它小分子、特異性肽進行預測，進行更可靠的鑒定。

　　4D流程提升信心，空間組學再辟新徑

　　談到timsTOF技術對未來生命科學的影響力，Rohan表示：timsTOF為研究者提供了更佳的選擇，他們可使用其關鍵優勢展開4D工作流程，如4D-脂質組學、4D-糖組學、4D-蛋白質組學，利用CCS值提升鑒定的信心。所有的問題都是從未知開始的，比如獲得一張MS/MS譜圖，由于共洗脫其不確定度很高，CCS可提高鑒定的可信度，讓人們以更高的信心研究他們以前從未見過的化合物。

　　布魯克首次在timsTOF fleX上引入MALDI導向的空間定位組學，它對脂質信號非常靈敏，對脂質組學提供了關鍵技術。在timsTOF fleX前可以做MALDI、做MALDI-2，對MALDI離子化后的信號利用CCS離子TIMS，還可以繼續做高靈敏度LC/MS分析、各種多組學分析，這種多用途為科學研究開辟了廣闊的空間。

　　Rohan小結說：timsTOF系列提供的獨特工具可解決極富挑戰性的難題。比如癌癥發病率正在上升，越來越多的癌癥檢測中，異質性、難以確認都是難題。空間定位組學幫助人們看清腫瘤組織，指導分離特定細胞，甚至從5、6個細胞達到單細胞水平。然后人們研究脂質組學、蛋白質組學、表型蛋白質組學等，timsTOF系列提供了前所未有的工具：高靈敏度、高特異性、利用CCS提升鑒定信心、高穩健性，連續運行成千上萬個樣品而無需停機。

　　收購和投資

　　Rohan分享了布魯克近期的投資動態。布魯克去年收購了Scripps研究所的生物信息學公司IP2，并推出了PaSER搜索引擎軟件，為研究者提供'Run＆Done'實時的結果。布魯克今年推出升級版本，增加了MOMA、TIMScore和de novo測序等功能。

　　布魯克還參與投資了Adeptrix，其技術有助于所有的生物標志物驗證分析。基于磁珠的質譜技術（BAMS）對于MALDI應用來說相當驚人。Adeptrix的技術為所有疾病分析帶來福音，它不僅可以分離蛋白質，還可以分離肽，并提高靈敏度，可在MALDI-TOF上進行非常高通量的分析。

　　布魯克投資的另一家公司是高清空間蛋白質組學領域的先驅IONpath，他們擁有標記成像技術。IONpath使用斯坦福大學開發的MIBI（多重離子束成像）系統，利用金屬標簽（metaltags）來觀察細胞內的信息標記，從而進行亞細胞的蛋白質成像。在MALDI成像方面布魯克有一個積極的計劃，而IONpath提供了更廣泛的視野，從10微米到400納米，或進行亞細胞的蛋白質成像。

　　布魯克還對GlycoPath公司進行了種子輪投資，他們開發GlycoTyper糖型生物分析的技術平臺，該技術由南卡羅來納醫科大學開發，并獲得 MUSC 研究開發基金會的許可。用MALDI-TOF研究肝病的首要一步就是觀測肝纖維化（liver fibrosis）水平，因為有些肝纖維化會發展為肝癌。GlycoPath正試圖開發一種快速檢測方法，利用質譜法測定肝纖維化。

　　質譜未來發展趨勢

　　Rohan談到未來質譜的發展趨勢時說，人們永遠追求高靈敏度和高特異性。回望過去近30年質譜的演變，布魯克一直都在這樣努力。質譜儀的靈敏度始終有較大的提升空間，即使用timsTOF SCP單細胞分析質譜，目前可以檢測單細胞中大約2,000多個蛋白質，未來還需要繼續提升，檢測單細胞中超過10,000種蛋白質。

　　質譜在許多方面還有進一步提升的空間，如何讓研究者更容易地獲得更多的蛋白質組學結果。迄今，布魯克提供了脂質組學的成像數據，為多組學分析、為單細胞（或少數5-6個細胞）分析提供更深入的4D-蛋白質組學和更深入的4D-代謝組學。研究者將這些數據合并考慮，可以進行決策或讓這些數據具有可操作性。因此，融合各種智能采集方法很重要，比如dia-PASEF或prm-PASEF，這使研究者可對蛋白質組進行高靈敏度的無標記定量（LFQ）；進行強大的MALDI成像來觀察不同的癌癥，了解癌癥的亞型、進行脂質組分析；還可以用LC-MS獲得更多結果。布魯克的產品線提供了各種工具來解決復雜的、挑戰性的問題。雖然布魯克也有一些基本的工具可用于食品檢測和常規市場；但布魯克主要聚焦于為科研人員提供更先進的工具來解決挑戰性難題。科研人員可根據需要，綜合使用MALDI和電噴霧質譜這些高靈敏度工具來觀察疾病。布魯克的未來重點是在全球范圍內，在人類攻克癌癥的舞臺上扮演重要角色。

　　布魯克質譜未來戰略

　　Rohan談到中國區的表現時說：布魯克中國區在何磊的帶領下，質譜的銷售每年以兩位數的速度快速增長。比如華南生物醫藥研究院一次訂購6套timsTOF系列質譜儀，其中包括了全球第一臺timsTOF SCP，這是15年來的第一次，布魯克成為多組學研究的主要參與者，許多研究機構都將目光投向了布魯克。

　　談到布魯克未來3-5年的戰略時Rohan表示：在中國的戰略也是我們在全球各地的戰略，即成為全世界癌癥機構的主要合作伙伴，成為全世界學術機構的主要參與者，集合研究型醫院的力量和學術界的基礎研究，我們希望幫助解決全球各地常見的特定癌癥。布魯克設立了許多積極的項目來同研究團體合作，而全球的科學團體也通過ASMS、ACCR（美國癌癥研究學會）大會等保持著密切的聯系。我們想同更多的生物學家合作，將基因組學和表型組學連接起來，在癌癥研究方面基因組學已取得很大進展，并嘗試將其應用于其它多組學。我們非常愿意成為基因組學界的一員，引進蛋白質組學、脂質組學，并將下一波多組學應用帶到中國。這是我們正在全球開展的一項關鍵舉措。

　　中國對布魯克來說非常重要，我從1995年就首次來到中國。多年來中國科學已取得了巨大的進步，中國科研機構的研究水平等同或超越了全球許多科研機構。我非常高興看到這一點，并希望布魯克能助力中國科學的快速發展，攀登上更高的山巔。