恩諾沙星和環丙沙星殘留檢驗的高效液相色譜法

(1)試劑和材料  以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純試劑，水為符合GB／T6682規定的二級水。

①環丙沙星  含環丙沙星不得少于99．0％

②恩諾沙星  含環丙沙星不得少于99．0％

③乙腈：色譜純

④三乙胺

⑤氫氧化鈉

⑥磷酸二氫鉀

⑦磷酸

⑧5．0mot兒氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉飽和溶液14ml，加水稀釋到100ml；

⑨0．03mot／L氫氧化鈉溶液：取5．0mol／L氫氧化鈉溶液o．6ml，加水稀釋到100ml。

⑩0．05mol／L磷酸／三乙胺溶液(pH 2．4)：取85％的磷酸3．4ml，加水稀釋到1000ml，攪拌下滴加三乙胺，調pH值至2．4。

⑾磷酸鹽緩沖液(用于肌肉、脂肪組織)：取磷酸氫鉀6，88，加水溶解并稀釋至500ral，用lOmol兒氫氧化鈉溶液調pH值至7.0。

⑿磷酸鹽緩沖液(用于肝臟、腎臟組織)：取磷酸氫鉀&8g，加水溶解并稀釋至600ml，調pH值為4．0～5．O。

⒀環丙沙星、恩諾沙星標準貯備液：稱取環丙沙星、恩諾沙星對照晶各50mg，用o．03mol／L氫氧化鈉溶液溶解并稀釋成濃度為lmg／mI的貯備液，置2～8℃冰箱中保存，有效期為1個月。

⒁環丙沙星、恩諾沙星標準工作液：準確量取適量環丙沙星、恩諾沙星標準貯備液，用乙腈稀釋成適宜濃度的環丙沙星、恩諾沙星標準工作液。

(2)儀器和設備

①高效液相色譜儀(配熒光檢測器)

②分析天平  感量0．0001g

③天平  感量O．01g

④渦旋振蕩混合器

⑤組織勻漿器

⑥離心管  25m1、

⑦固相萃取裝置

⑧離心機

⑨C18固相萃取柱

(3)測定步驟

①提取  稱取(2i 0．05)z試料，置于30ml勻漿杯中，加磷酸鹽緩沖液10．0ml，1]0000r／min勻漿llnin。勻漿液轉入50ml離心管中，振蕩混合5min，4000r／min離心10rain，上清液轉入另一25ml離心管中。用磷酸鹽緩沖液10．0mi洗刀頭及勻漿杯，轉入50ml離心管洗殘渣，攪勻，振蕩，離心。合并上清液于25ml離心管中，備用。

②凈化  Cis固相萃取柱依次用2ml甲醇、2ml潤洗，潤洗完畢后，準確量取適量備用液過柱，用2ml水洗，擠干。加2．0ml流動相洗脫，擠干。收集洗脫液作為試樣溶液，供高效液相色譜分析。

③標準曲線的制備   準確量取適量環丙沙星、恩諾沙星標準工作液，用流動相稀釋成濃度為0．002ug／ml，0．005ug／m1，0．01ug／ml，0．05ug／m1，0．10ug／m1，O．30ug／ml，0.50ug／ml的環丙沙星、恩諾沙星標準溶液，供高效液相色譜分析。

④測定

a.色譜條件

色譜柱：C18 250mm×4．6mm(內徑)，粒徑5／tm，或相當者。

流動相：0．05mol／L磷酸溶液／三乙胺—乙腈(82+18)

流速：0．8mi／mid。

檢測波長：激發波長280nm；發射波長450nm

進樣量：20uL。

b.測定  取適量試樣溶液和相應的標準工作溶液，作單點校準或多點校準，以色譜峰面積積分值定量。標準工作液及式樣液中的環丙沙星、恩諾沙星響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內。在上述色譜條件下，環丙沙星、恩諾沙星的保留時間分別在11min和8min左右。

⑤空白試驗  取空白試料，采用完全相同的測定步驟進行平行操作

(4)靈敏度和回收率

本方法在雞的肌肉、脂肪、肝臟和腎臟組織中的檢測限為環丙沙星20ug／kg、恩諾沙星在5～20ug／kg

在2～20ug/kg添加濃度水平上，回收率范圍為79．27％～98．74％。