懸浮細胞的免疫熒光標記實驗

懸浮細胞

多聚-L-賴氨酸

離心機培養箱

1.  細胞在冰浴中冷卻，然后用臺式離心機于4℃以800 g 離心5 min，吸去培養液并以4℃PBS重懸細胞。

2.  離心吸去PBS，以1~2 ml 2%PFA固定液，或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重懸細胞，置冰上固定30 min。

3.  離心、吸去固定液，用15 ml 4℃ PBS重懸細胞，放5 min 后，用PBS再次洗滌細胞。

4.  稀釋的第一抗體于4℃用微量離心機以13 500 g 離心2 min，250 μl 抗體足夠用于5x10⁶細胞。

5.  離心細胞，吸去PBS，重懸細胞于第一抗體中，置4℃溫育1 h。
 

6.  用4℃ PBS稀釋細胞和抗體至15 ml。

7.  離心，吸去PBS，以4℃ PBS重懸細胞，重復1次。

8.  第二抗體4℃用微量離心機以13 500 g 離心2 min，5x10⁶細胞用250 ul 抗體足夠。

9.  吸去PBS，以第二抗體重懸細胞，4℃溫育1 h，重復步驟6及步驟7。

10.  除非立即觀察細胞，否則在進行細胞濃縮的下一步操作之前應以鋁萡包裹離心管并冷藏。

11.  離心細胞并以少量PBS重懸（勿用水），將細胞懸液滴于多聚-L-賴氨酸覆層的載玻片上，加上蓋玻片，盡可能馬上觀察結果。

1、熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，可能會使熒光提前衰退。

2、每次試驗均需設置以下三種對照：

    (1) 陽性對照：陽性血清+熒光標記物;

    (2) 陰性對照：陰性血清+熒光標記物;

    (3) 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物。