感受態細胞的制備及溶液配制

實驗試劑

LB培養基，KB培養基，10%甘油，液氮，0.1M CaC1₂ 溶液

實驗設備

超凈工作臺，搖床，離心機，250mL離心瓶，0. 5mL的離心管

實驗材料

大腸桿菌，農桿菌和假單胞桿菌

實驗步驟

1. 電擊感受態細胞的制備

    1) -80℃ 保存的大腸桿菌，農桿菌或者假單胞桿菌在固體平板上(DH5a，BL21在LB平板上，GV3101在LB/Gen; P.s. pv. tomato 0288-9和P. syringae pv. tabaci 6505在KB平板上)劃線。

    2) 接種單克隆于5-10mL液體培養基，37℃ (大腸桿菌)或者28℃ (農桿菌和假單胞桿菌)培養過夜。

    3) 按照1:100-1:500轉接到500-1000mL液體培養基，37℃ 培養3-4小時(大腸桿菌)或28℃ 培養8-10小時(農桿菌和假單胞桿菌轉化)至細菌達到對數生長期。

    4) 將菌液裝入250mL離心瓶中，冰上放置30分鐘后，4℃ 離心15分鐘。

    5) 棄上清，加入200mL 10%甘油，于冰上緩慢將菌搖散，4℃ 離心15分鐘。

    6) 重復前一步驟2-3次，最后棄上清，加入少量10%甘油重懸細菌。

    7) 分裝于0. 5mL的離心管中，每管40ul，液氮速凍，-80℃ 存放。

2. 熱激感受態的制備

    1) 挑取E.coli BL21單克隆接種到5mL LB培養液中，37℃ 振蕩培養過夜。

    2) 按照1:100-1:500轉接到500-1000mL液體培養基，37℃ 培養3-4小時至細菌達到對數生長期。

    3) 將菌液裝入250mL離心瓶中，冰上放置30分鐘后，4℃ 離心15分鐘。

    4) 棄上清，加20mL預冷的0.1M CaC1₂ 溶液輕輕懸浮菌體，冰上放置15-30分鐘后于4℃ 離心5分鐘。

    5) 棄上清，加2mL冰預冷的0.1M CaC1₂ 溶液，重懸菌體。

    6) 分裝于0. 5mL的離心管中，每管40ul，液氮速凍，-80℃ 存放。