材料、設備及試劑
一. 材料
E. coli DH5α，BL21菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；T-vectorDNA: 購買或實驗室自制，eppendorf管。
二. 設備
恒溫搖床,電熱恒溫培養箱,臺式高速離心機,無菌工作臺,低溫冰箱, 恒溫水浴鍋, 制冰機, 分光光度計,微量移液槍。
三. 試劑
1.LB固體和液體培養基
2.含Amp的LB固體培養基:將配好的LB固體培養基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,搖勻后鋪板。
3.0.05mol/L CaCl2溶液:稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。
4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。
操作步驟
一、 受體菌的培養
從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落,接種于3-5ml
LB液體培養基中,37℃下振蕩培養12小時左右,直至對數生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml
LB液體培養基中,37℃振蕩培養2-3小時至OD600 ＝0.5左右。
二、 感受態細胞的制備 ( CaCl2 法)
1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘。
2、 棄去上清,用預冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘。
3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液。
4、 感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存于-70℃可保存半年。