感染性疾病基因診斷進展

感染性疾病有病原微生物引起，致病的病原微生物主要有病毒、細菌、衣原體、支原體和螺旋體等。這些病原體的傳統檢測方法通常采用形態學檢查，體外培養和免疫學試驗。但對某些難以培養的病原體，抗原抗體檢測不能判斷體內病原體 DNA 或 RNAde 復制情況，或存在檢測靈敏度低等問題。自聚合酶鏈反應（ PCR ）技術問世以來，基因診斷技術作為病原體檢測的新方法得到突飛猛進的發展。

一、病原體基因診斷的主要技術方法

1 、實時熒光定量 PCR （ Real Time Flourescence quantitative PCR, FQ—PCR ）

　　聚合酶鏈反應（ PCR ）技術雖已被廣泛應用于核酸分析，但普通 PCRhai 存在一些不足：

（ 1 ）只有定性結果，無法給出臨床需要的定量結果；

（ 2 ）由于采用電泳檢測，易引起 PCR 產物的交叉污染，增加了假陽性結果的可能性；

（ 3 ）采用的染色劑溴乙錠是致癌物，可能危害操作人員及污染環境。

　　為了解決上述問題，建立了定時熒光定量 PCR 方法（ Real Time Flourescence quantitative PCR,FQ—PCR ） , 其中應用最廣泛的是 TaqMan 法。該技術在常規 PCR 基礎上，添加了一條標記 2 個熒光基團的熒光雙標記探針。一個標記在探針的 5' 端，稱為熒光報告基團（ R ）；另一個標記在探針的 3' 端，稱為熒光抑制基團（ Q ）。探針的 3' 羥基（ -OH ）已被去除或封閉，不具有延伸能力。在探針分子完整的情況下， R 發出的熒光被 Q 淬滅吸收。此時檢測不到熒光信號。當特異性 PCR 擴增發生時，探針會在 PCR 過程中被 Taq 酶的 5'--3' 活性作用切斷（切口平移效應），抑制作用消失，從而引起報告基團熒光信號的產生。熒光信號伴隨 PCR 產物的增長而增長。實時熒光定量 PCR 方法就是利用此原理，在 PCR 過程中，連續不斷的檢測反應體系中熒光信號的變化。當信號增強到某一閾值（根據熒光信號基線的平均值和平均標準差，計算出以 99.7% 的置信度大于平均值的熒光值，即為閾值）時，此時的循環次數（ Ct 值）就被記錄下來，該循環參數和 PCR 體系中起始 DNA 量的對數值之間有嚴格的線性關系，利用陽性梯度標準品的 Ct 值，制成標準曲線，再根據樣品的 Ct 值就可以準確定出起始 DNA 的數量。目前用于臨床檢測的病原體基因診斷試劑絕大部分是此類。

2 、基因芯片（ Gene Chip or microarray ）

　　基因芯片或微陣列是近年發展起來的分子生物學研究工具。在 1 平方厘米的芯片上可以同時分析幾百至數萬個基因，具有高通量、快速獲取有關生物學信息的特點。基因芯片技術事實上是一個小型的反向點雜交系統，將幾百至數十萬個 cDNA 或寡核苷酸密集排列與固相支持物上，作為探針。把要研究的樣品 DNA （稱靶 DAN ）用熒光標記后與芯片上的探針進行雜交，透過掃描后，對雜交結果進行計算機軟件分析，根據雜交信號的強弱和序列即可確定靶 DNA 的表達情況以及突變和多態性的存在。基因芯片的優勢在于可以一次檢測多種病原微生物，不僅可進行病原微生物種、亞種、型的識別，同時可了解致病菌的致病基因和耐藥基因，以及尋找新的病原菌。目前基因芯片主要用于科研，要從實驗室研究推向臨床應用還有一系列問題需要解決。如提高特異性、簡化操作、降低成本等。

3 、其他方法

（ 1 ）羅氏公司（ Roche Diagnostic Systems, Inc. ）發展的 Cobas Amplicor 系統。

（ 2 ）轉錄介導的擴增系統 [Gen-Probe transcription-mediated amplification (TMA ) system ]

（ 3 ）鏈接酶鏈式反應（ LCR ）

（ 4 ）鏈置換擴增（ SDA ）

二、病原體基因診斷的應用

　　目前病原體基因診斷在臨床上最大的用途是檢測難于培養的病原體。另一個用途是在治療中將病毒載量檢測作為療效檢測手段。第三個用途是治療過程中檢測耐藥基因突變。第四是用于血液篩查。第五是用基因分型方法進行病原體種群分類。

１、肝炎病毒檢測 （ 1 ）乙型肝炎病毒 HBV

　　免疫學標志有一定的敏感性和特異性，但不能定量。在確定病毒是否復制及抗病毒治療監測方面熒光定量 PCR 具有很好的指導意義。在國內應用最廣泛的病原體基因診斷項目。

　　在母嬰傳播的監控中 PQ-PCR 技術能快速、準確檢測孕婦血中 HBV-DNA 的數量，醫生可及時對患者進行診斷治療，從而大大降低通過母嬰傳播 HBV 病毒的幾率。

　　耐藥突變監測室另一重要用途。抗病毒治療是慢性乙型肝炎的根本治療方法，基本治療目標是清除或永久抑制乙型肝炎病毒的復制，降低致病性和傳染性，消除或減輕肝臟的炎癥和壞死。目前的抗病毒治療藥物主要是干擾素和以拉米夫定為代表的新一代核苷類似物。拉米夫定作為第一個獲 FDA 批準的口服抗 HBV 藥物，、其問世推動了慢性乙型肝炎治療的進程。雖然拉密夫定治療慢性乙肝療效顯著，但長期使用拉米夫定會出現耐藥現象。使用一年、二年、三年、四年的耐藥比率為 15-32% 、 38% 、 49% 、 66% 。因此，服藥前期及服藥期間監測 YMDD 的變化及 HBV DNA 含量就顯得十分重要。拉米夫定耐藥的主要原因是病毒多聚酶基因的 YMDD （酪氨酸－蛋氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸）區域發生突變，即由 YMDD 突變為 YIDD 或 YVDD ，從而產生耐藥。蛋氨酸突變為異亮氨酸 Ⅰ或 纈 氨酸Ⅴ，氨基酸殘基的側鏈變短，結合域變大，從而降低了拉米夫定的親和力，減弱拉米夫定對突變病毒復制的抑制能力。采用聚合酶鏈式反應（ PCR ）結合 Taqman 熒光探針技術，對血清中乙肝病毒拉米夫定耐藥相關的多聚酶基因變異情況進行檢測。監測乙型肝炎患者服用拉米夫定后體內是否產生耐藥突變病毒，以此正確評估患者體內 HBV 病毒耐拉米夫定的情況。

（ 2 ）丙型肝炎病毒 HCV

　　HCV 是 RNA 病毒。實時熒光定量逆轉錄 PCR 可擴增 RNA ，檢測 RNA 病毒并能加以定量。臨床上須具備一種高敏感和準確定量 HCV 的方法來診斷和檢測病人體內 HCV 病毒情況。實時熒光定量檢測系統能達到這一要求。

2 、結合桿菌（ TB ）檢測

　　肺結核是世界上最主要的傳染病之一，每年造成超過 200 萬人死亡和新增 800 萬病人。由于病原體結合分支桿菌緩慢的生長率，分離、鑒定和藥物敏感試驗需數星期或很久。基于核酸擴增的分子生物學方法能將診斷時間大大縮短。實驗證明，定量檢測痰標本結核桿菌 DNA 與顯微鏡檢查所得的抗酸桿菌（ AFB ）的數目相關性很好。在治療開始之前，檢測 AFB 、 TB DNA 和可培養的桿菌數十相似的，提示 DNA 定量是檢測最初桿菌載量的好方法。然而， AFB 和 TB DNA 消失的速率都與可培養桿菌的下降不相關，以此不適合監測治療效果。耐藥的結核分支桿菌對于 TB 的控制是個嚴重的威脅。結核桿菌對一種或多種結核藥物的耐藥是發生基因突變及突變的積累所造成。以 PCR 為基礎的 DNA 序列測定和基因芯片技術是快速檢測 TB 耐藥突變的有效方法。

3 、性傳播疾病病原體檢測 （ 1 ）沙眼衣原體（ CT ）

　　CT 除致沙眼外，在臨床上引起泌尿生殖道感染早已公認，且影響患者生活。但其細胞培養較難直接應用于臨床檢測。直接免疫熒光測定有一定主觀因素。 PCR 克服了以上諸方面缺點。

（ 2 ）人類免疫缺陷病毒（ HIV ）

　　病原體感染后的發病時間和病情輕重均與病原體數量有關。例如 HIV 感染后，潛伏期長短和臨床癥狀輕重與血液中的病毒量顯著相關，甚至可根據 HIV 的量準確預測發病時間。病毒載量也是預測異性戀伴侶間 HIV 傳播風險的主要因素，在 HIV-RNA 水平小于 1500 拷貝 /ml 時， HIV 的傳播很少發生。

4 、免疫受損人群的病原體檢測

　　免疫受損人群包括愛滋、器官移植、惡性腫瘤、放射損傷等病人。器官移植病人使用免疫抑制劑造成免疫功能低下，易感染巨細胞病毒（ CMV ）、 EB 病毒等，使受者發病和死亡的重要原因。實時 PCR 可定量檢測血液中病毒載量，有助于臨床診斷病毒相關疾病和監測病人體內病毒變化情況。研究表明，以 1000 拷貝 /105 白細胞為預測 CMV 病癥狀發作的閾值，其敏感性為 35% ，特異性為 100% 。重要的是定量 PCR 分析法必須標準化，必須指定俞分析所用 DNA 量相當的細胞數，便于不同時間、不同實驗室所得結果的比較研究。

5 、血液篩查

　　血液篩查主要為免疫學方法。輸血危險性來源于窗口期獻血，病毒變異，非典型免疫應答和實驗室檢測的失誤。 1999 年歐洲共同體、美國、日本相繼把獻血員篩查乙肝、丙肝、艾滋病毒。

6 、與胎兒發育異常有關的病原體檢測

　　研究表明，孕婦宮內感染弓形蟲 TOX 、風疹病毒 RV 、巨細胞病毒 CMV 、單純皰疹病毒 HSV 等病原體有可能引起胎兒發育異常。實時熒光定量 PCR 可檢測孕婦羊水標本中病毒載量，作為是否終止妊娠的輔助指標。

7 、與惡性腫瘤有關的病原體檢測 （ 1 ）人乳頭瘤病毒（ HPV ）與宮頸癌

　　HPV 感染已被流行病學和生物學證明，是引起子宮頸癌的重要因素。高危型 HPV （如 16 ， 18 型）持續感染能夠提高子宮頸癌風險 250 倍。持續感染依賴于長期持續的高病毒載量。 HPV DNA 定量檢測作為篩查手段將為降低癌發病率和死亡率起到積極作用。

（ 2 ） EB 病毒與鼻咽癌

　　EB 病毒與鼻咽癌的發生有密切俄相關性，被列為可能致癌的人類腫瘤病毒之一。

　　EB 病毒的血清學檢查一直是鼻咽癌的重要輔助診斷方法之一。研究發現運用實時定量 PCR 技術在 96% 的鼻咽癌病人和 7% 的正常對照血漿中檢測到游離細胞 EB 病毒 DNA ，鼻咽癌患者血漿中游離細胞 EB 病毒 DNA 拷貝數明顯高于正常對照組陽性者，且與臨床分期、治療效果和預后有很好的相關性。

8 、基因分型方法用于病原微生物分類

　　應用核酸雜交、基因擴增、 DNA 序列測定及多態性分析技術可進行微生物的基因分型，該技術在微生物種群分類、基因結構分析、傳染病的流行病學調查中均有較高的應用價值。

三、基因診斷試劑

1 、實驗室自行配制的試劑， Home-brew assay-HB 。

　　可用于臨床檢測，多為人類基因檢測項目，對實驗室科研水平要求高，需嚴格的質量控制。

2 、科研用商品化試劑盒， Research use ohly （ RUOkit ）。

　　可用于科研，不能作為收費的臨床檢測項目。

3 、分析物特異試劑盒， Analyte spedific reagent kit （ ASR ）。

　　試劑盒中不包括引物和探針，用于臨床時需要類似 HB 的嚴格質量控制。

4 、 藥品監督管理局認證的試劑盒，可用于臨床檢測，但數量較少。

　　美國 FDA1996 年批準第一個用于病原體診斷的產品（沙眼衣原體 CT ）。我國 1999 年正式批準第一個用于臨床的 PCR 試劑（乙肝病毒）。進口試劑價格昂貴，作為疾病常規檢測手段難以承受。我國目前主要依賴于國產 PCR 試劑（表 1 ）。

表 1 已通過國家藥品食品監督管理局（ SFDA ）審批的基因診斷試劑（截至到 2005 年 7 月）

四、關于實驗室資格認證

　　開展病原體基因診斷的實驗室需經過資格認證，實驗人員要經過上崗培訓。全國已有幾百個實驗室通過認證。北京市已通過衛生部臨床檢驗中心資格認證的實驗室見表 2 。希望開展病原體基因診斷的實驗室主動積極地申請認證。外送標本的單位要送到有資質的實驗室，以便保證臨床基因診斷的質量。

表 2 北京市已通過衛生部臨床檢驗中心資格認證的臨床基因擴增檢驗實驗室（截至到 2005 年 7 月）

五、病原體基因診斷的發展趨勢

1 、提高自動化程度。從標本預處理、核酸提取到基因擴增和產物檢測都有望實現自動化，可將人為誤差降到最小，提高檢測的精確度，提高工作效率。

2 、測定方法和工作程序的標準化。通過標準化改善實驗室測定準確度，從而提高不同實驗室間結果的可比性。

3 、在嚴密設計的臨床應用研究基礎上，確定每一個基因診斷項目適用得范圍，避免濫用造成的困擾和不必要的費用。

4 、開發更加快捷廉價的檢測方法。例如美國康奈爾大學報到一種不同于基因擴增的方法。先經加熱酶解將核酸從血液細胞中釋放出來，再將特制的測試棒置于其中停留幾分鐘。測試棒上注入了與被測病原體特異 RNA 片段精確匹配的 DNA 片段，如果待測 RNA 存在，他將與互補 DNA 結合并顯示紅色。該方法從開始到完成僅需 30 分鐘。