慢病毒感染目的細胞實驗步驟

1. 感染預實驗

以 24 孔培養板為例，同時進行目的細胞和工具細胞的感染預實驗。工具細胞可選擇 293T（人胚腎上皮細胞）、H1299（人肺癌細胞）或其它細胞。實驗材料：培養基、24 孔培養板，移液槍，槍頭， EP 管，細胞計數板、冰盒、廢液缸等。（根據目的細胞情況，可酌情使用 Polybrene）

Day1：
準備細胞：培養細胞至對數生長期，細胞以胰酶消化計數后，用細胞計數測出細胞密度，每孔接種 5×104 個細胞，添加細胞培養液至 500μL。通常情況下，該接種量的 H1299 或 293T 細胞在感染后第 3 天可生長至 80%-90% 融合度。（接種目的細胞時，請根據細胞的實際生長速度調整接種量，使目的細胞感染后第 3 天生長至 80%-90% 融合度）

Day2：
（1）準備慢病毒顆粒：計算所需慢病毒顆粒的量，將凍存在 -80℃ 的慢病毒顆粒取出，冰浴融化；
（2）感染目的細胞：從培養箱中拿出細胞，置于顯微鏡下觀察細胞生長狀態及細胞融合度；如細胞狀態較好，則開始實驗：
A. 用移液槍小心吸去 24 孔板中的舊培養液，加入新的完全培養液；
B. 在細胞中分別加入計算好的慢病毒顆粒液，將培養板平置于工作臺上，以劃 8 字的方式輕柔混勻；
C. 混勻后，細胞培養板置于 37℃、5% CO2 培養箱，過夜培養。

Day3：
更換培養液：感染 12-16 小時后，吸出含慢病毒顆粒的培養液，重新向培養板添加含 5% 滅活 FBS（胎牛血清）的培養液，繼續培養。（目的細胞需要調整感染時長，部分細胞不可感染超過 12 小時。）

Day4：
繼續培養細胞，觀察細胞狀態是否有異常。

Day5：
觀察（評估）慢病毒顆粒感染效率：蓋緊 24 孔培養板，使用 70% 乙醇清理培養板外壁，在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，拍照并估計慢病毒顆粒對細胞的感染效率。（如果慢病毒顆粒攜帶的基因表達所需的時間較長，熒光表達所需時間也較長，建議感染 72、96 小時后觀測熒光表達。）

根據熒光情況，可以初步從 MOI 梯度摸索實驗中，找出目的細胞的 MOI 值。