戊二醛二步交聯法制備酶標抗體

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戊二醛連接反應

戊二醛（glutaraldehyde，GA）：是一種常用的同型雙功能交聯劑，它的兩個醛基可分別與HRP和抗體蛋白的氨基形成Schiff堿（-N=C-），將他們以五碳橋連接起來。

戊二醛連接反應是最溫和的交聯反應之一。可在4-40℃范圍，pH6.0-8.0的緩沖液中進行。另外，GA縮合體使被結合的蛋白分子與分子之間的間隔延長，可免于使蛋白分子的三級結構發生改變。

操作步驟

1. 用0.05mol/L， PH9.5碳酸鹽緩沖液(CBS)將25%戊二醛稀釋至5%；

2. 稱取5mgHRP 溶于0.5ml 5%戊二醛，37℃水浴結合2h；

3. 加入220.0g/L NaCl 0.1ml， 充分混勻后，置4℃10min預冷；

4. 加冷無水乙醇2.4ml，顛倒混合，立即1000r/min離心10min；

5. 棄上清，沉淀用冷80%乙醇洗一次，將離心管倒置，控干；

6. 加入0.05mol/L， PH9.5 CBS 0.5ml溶解沉淀物；

7. 將5mg抗體溶于0.5ml 0.15mol/L NaCl，再與醛化HRP溶液混合；

8. 加入1.0mol/L， pH9.5 CBS，調節pH值至9.0-9.5；

9. 于4℃，電磁攪拌下結合24h；

10. 加入0.1ml O.2mol/L賴氨酸，以封閉殘留的醛基，終止反應；

11. 4℃放置2h；

12. 將反應物通過Sephadex G-200凝膠柱，用PBS洗脫，收集第一洗脫峰；或將反應物裝入透析袋，對0.01mol/L，pH7.2 PBS，4℃透析過夜并收集； 即為酶標記抗體。

注意事項

1. 所用的戊二醛A235/A280為10左右，未經蒸餾等處理。

2. 酶的醛化時間37℃2h、4h和4℃16h無明顯區別。

3. 醛化時，使用的緩沖液以CBS為宜。

4. 加入220.0g/L NaCl 的目的主要是提高離子強度，以便乙醇沉淀。

5. 根據有關文獻的報道，用50%飽和硫酸銨鹽析或Sephadex G-200凝膠柱層析，對于ELISA檢測并無實際意義，并常使酶與抗體的活性大量喪失，且這兩種純化法不能去除未標記的抗體，需用ConA-Sepharose 4B純化才能達到，因此，在常規工作中，鹽析和過柱的純化步驟可以省