成纖維細胞的分離技術

實驗概要

本實驗分離了成纖維細胞，所述的通用操作方案適用于小鼠、大鼠、倉鼠和雞胚胎。

實驗步驟

選擇大約一半足孕時間的胚胎最好，10-13天齡胚胎含有最大數量的未分化的間質細胞，成纖維細胞可從這些細胞衍生獲得。
1. 胚胎的分離

   1) 適用哺乳動物（倉鼠、小鼠和大鼠）
   a.采用認可的方案處死嚙齒動物
   b. 立即在無菌超凈臺內用70%乙醇擦洗整個動物。若可能，置紫外燈下照射5min。
   c. 用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后退。
   d. 用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，去除含有胚胎的子宮，置于無菌的培養皿上。
   e. 剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的燒瓶中。
   f. 漂洗胚胎，去掉PBS。繼續用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。

   2) 適用雞胚胎
   a. 用70%乙醇擦洗雞蛋殼。
   b. 用無菌剪刀輕敲雞蛋的圓端，輕輕去除蛋殼露出氣囊。
   c. 用無菌鑷子去除覆蓋于絨毛尿囊上的白膜。
   d. 剪開包膜，用彎鑷夾住胚胎頸部去除胚胎。
   e. 棄頭部，將無頭的胚胎置于廣口燒杯中，用PBS漂洗。

2. 將6-8個胚胎轉移至一個小的無菌廣口燒杯中，用新的無菌剪刀小心地絞碎胚胎，用PBS漂洗。
3. 在無菌狀態下，將絞碎的胚胎轉移于一500ml的無菌的有攪拌棒的燒杯中，加入200-300ml用HBSS配制的0.25%的無菌胰蛋白酶。
4. 在溫暖的環境中或置于37℃培養箱中輕輕攪動15min。
5. 讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮細胞的液體轉移至一無菌大容積的離心管中，該管內按照每10ml上清加入1ml牛血清的比例加入牛血清以滅火胰蛋白酶。
6. 加入新鮮胰蛋白酶溶液（見前述步驟）于含有殘留未消化組織塊的500ml燒杯中，重復步驟4和5。
7. 離心混合的細胞懸液，1200r/min，5min，棄上清。
8. 用新鮮的無菌PBS重懸沉淀的細胞，按步驟7再次離心。
9. 用PBS反復洗滌細胞直至上清清亮為止。
10. 用含有10%牛血清和抗生素（如青霉素、鏈霉素）的DMEM 10ml再懸沉淀，并使終體積為100ml。
11. 讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質沉降。可采用數層無菌紗布過濾細胞懸液以去除任何殘留的細胞快。
12. 為確定現有細胞濃度，加入0.2ml細胞懸液于1.8ml 1%醋酸溶液中以裂解紅細胞，用血細胞計數器進行細胞計數。
13. 按每10mm平皿1*10⁷至4*10⁷細胞的數量接種于10ml組織培養液中，在飽和濕度的37℃ CO₂培養箱中孵育直至細胞鋪滿。
14當細胞長滿后，去除培養液，用10%的溫暖的Versene（用PBS配制的0.53nmol/L EDTA），洗滌細胞層2次。
15. 棄Versene，加入相同體積的溫暖0.05%胰蛋白酶-EDTA。
16. 37℃孵育5min。
17. 用無菌吸管輕輕吹散細胞，并轉移至一含有1-2ml牛血清的無菌管中。牛血清的終濃度約為10%，起到中和胰蛋白酶的作用。
18. 離心，1200r/min，5min，棄上清。
19. 再懸沉淀于5ml培養液中，另加入15ml培養液，分裝于2個100mm平皿中。
20. 置37℃飽和濕度的CO₂培養箱中培養細胞，直至細胞長滿，繼續步驟14-20以傳代細胞。