扒一扒藏于百億驚天騙局背后的液體活檢技術！

　　 有這樣一個人，她號稱可以用一滴血檢測幾百項生理指標，被稱為女版喬布斯。

　　就在近日，她的百億驚天騙局被世人揭穿并最終宣告破產，她就是在朋友圈引起軒然大波的伊麗莎白，而這項技術便是液體活檢技術。

　　幸而這只是個別極端，我國東南大學團隊研制的癌癥檢測儀，已經可以僅憑一滴血就完成16項癌癥篩檢。那么這項技術究竟是什么呢？

　　液體活檢技術主要包括游離循環腫瘤細胞（CTCs）檢測、循環腫瘤DNA（ctDNA）檢測、外泌體及循環RNA（Circulating RNA）檢測等。今天筆者要說的便是游離循環腫瘤細胞（CTCs）檢測。

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  初始于21世紀初的循環腫瘤細胞CTC研究

　　循環腫瘤細胞的廣泛研究始于21世紀初。初衷在于用相對簡單廉價的基于CTC的液體活檢取代昂貴且侵入性的外科活檢，然而，基于CTC的液體活檢技術從實驗室到臨床的轉化一度進展緩慢。

　　今年發表的關于在轉移性前列腺癌中使用液體活檢的腫瘤學報告評論中列出15個平臺，都可用于CTC富集和檢測研究。但唯一批準用于臨床的僅有CellSearch。

　　它于2008年被FDA批準用于CTC計數，且僅被批準用于乳腺癌，前列腺癌和結腸直腸癌患者。目前，醫生使用CellSearch計算7.5毫升血液樣本中的CTC數量。

　　事實證明，這些計數對于該技術獲得批準的三種癌癥的預后和監測是有用處的。例如，在晚期前列腺癌中，7.5mL樣品中的5個或更多細胞已顯示與更差的預后相關。

　　醫生還使用連續計數的CTC來監測治療的功效，但這些離研究者的預期依舊相去甚遠。研究人員希望近期的臨床研究成果能更快地將基于CTC的液體活組織檢查轉化到臨床。

　　除了計算CTC之外，他們現在正在對它們進行表征并使用該信息來做出治療決策。也正在研究多參數測試的使用，這些測試將利用CTC和另一種血液傳播的分析物循環腫瘤DNA（ctDNA）。

　　此外，生物技術公司與學術研究人員合作，正在努力推出新的，更靈敏的CTC檢索平臺，以期獲得FDA批準。

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　　以表征CTC選擇最佳治療方案

　　7月在JAMA Oncology上發表的一項研究中，來自Memorial Sloan Kettering癌癥中心的研究人員表示，他們可以利用CTC的特征來選擇晚期前列腺癌患者的最佳治療方案。

　　這項為期四年的盲法研究利用Oncotype DX AR-V7 Nucleus Detect測試來確定來自142名去勢抵抗性前列腺癌患者的CTC的細胞核是否含有一種名為AR-V7的蛋白質。

　　這是首次驗證液體活檢對治療反應的預測價值并證明存活益處的測試之一。研究人員發現，使用基于紫杉烷的化療治療時，核中存在這種變異的患者壽命更長。

在每張幻燈片估計有300萬個細胞上分析圖像文件中的多種免疫熒光和形態特征

　　Epic Science轉化研究合作負責人Ryan Dittamore表示：“這種治療決策的重要性絕對不容小覷。”該公司與Genomic Health合作提供核AR-V7測試。測試結果可在不到一周的時間內提供給醫生。

　　通過檢測所節省的天數對于病情迅速惡化的患者來說至關重要。研究人員還驗證了患者風險的測試，以確保生物標志物效應是由于生物標志物而不是其他臨床變量。

　　CTC具有預測價值，在一種癌癥中的發現可以為其他癌癥提供參考。2015年，Lucci及其同事在“國家癌癥研究所雜志”上發表的一項前瞻性研究結果顯示：

　　在III期炎癥性乳腺癌患者中，一種CTC的存在， 一種罕見的侵襲性疾病，在原發性化療后復發的風險很高。

　　2016年，他的另一項前瞻性研究中表明，基線時一個或多個CTC與IV期黑色素瘤患者在180天內的進展相關。兩種類型癌癥的CTC超與想象地相似。基于血液的黑色素瘤中CTC的檢測效果超出預期。

　　Lucci表示，他期待正在進行的臨床試驗結果，如目前正在歐洲進行的DETECT研究，正在研究在CTC中使用HER2表達來指導治療決策的可能性。

　　與此同時，Lucci及其同事正在研究使用連續抽血的CTC計數，以確定這些計數揭示了哪些乳腺癌和黑色素瘤患者對治療有反應。

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　　從CTC到ctDNA研究的轉變

　　盡管有這些進展，但CTC仍是癌癥患者血液中極為罕見的成分。由于新一代高通量測序技術的深度，準確性和成本的提高，大量研究已從CTC轉向循環腫瘤DNA（ctDNA）。

　　南極加州大學凱克醫學院的前列腺癌研究員Amir Goldkorn博士表示：“利用液體活檢可以看到你試管中的每一片DNA。研究人員更愿意規避分離癌細胞的復雜性，分析無細胞DNA在技術上更為直接。”

　　“CTC代表著構成原發性腫瘤和轉移的癌細胞的全部內容。DNA只是這一特征的一部分，而CTC是含有DNA，RNA和蛋白質全部補體的活細胞。”

　　ctDNA是腫瘤DNA的一個子集，DNA片段是從垂死細胞中釋放出來的。大型，前瞻性且控制良好的研究仍未完成。

　　這些需確定基于CTC的技術或基于ctDNA的技術，哪種能最好地為治療決策提供信息并改善臨床結果。

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　　多參數測試獲取多種信息

　　Goldkorn正在做的工作正是多參數測試，試圖從單一血液樣本中獲取各種信息，期望得到每種類型的數據在何種程度上重疊，以及它們在多大程度上提供了獨特的信息。

　　他的團隊正在進行試點研究，大型，前瞻性，多中心試驗。以期了解如何使用這些技術開發出最佳的預測和預后工具，以高效，廉價和非侵入性的方式為患者使用。

　　多參數研究的目標是采用不同的技術，將它們以集成的方式應用于單個血液樣本，并開發可以并行查看結果的工作流程，重要的是要看CTC和ctDNA。

　　研究人員還在研究基于RNA和蛋白質的測試，以及研究細胞外囊泡。一旦完成這些研究，它們將為商業化驗奠定基礎。

　　他們表示：“我們可能會發現需要CTC，因為需要計數和尋找（蛋白質）變體，但我們想要無細胞DNA數據，因為它們為我們提供了最好的腫瘤突變譜。”

　　但Daniel Danila，MD，是對多參數測試的未來持懷疑態度：“這在理論上是可行的。但在這些測試中使用的緩沖液比較特殊。“

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　　提高檢測靈敏度以改進CTC檢測

　　Danila的工作重點是改進CTC檢測。2016年，他及其同事在The Cancer Journal上發表論文，該論文表述AdnaTest Assay和ddPCR分析都比CellSearch更靈敏地檢測出加標血液樣本中的癌細胞。

　　AdnaTest在62％的樣本中正確發現了CTC，ddPCR檢測到69％的細胞，而CellSearch的檢測率僅為45％。

　　研究人員表示：“ddPCR檢測需要最低的血容量，最少的現場處理和最長的批處理穩定性，需要提高靈敏度。如果無法檢測到CTC，就很難監測患者，這些CTC可作為許多癌癥類型存活的替代指標。“

　　目前MenSearch的制造商Menarini Silicon Biosystems正在進一步開發其系統，該公司首席科學官NicolòManaresi博士表示：“CellSearch在CTC領域處于領先地位。因為CTC濃縮和計數的許多替代技術缺乏使用環境，標準化試劑和自動化程度的明確定義。“

　　該公司正在擴展可在CellSearch平臺上運行的分析菜單。它還投資于CellSearch與DEPArray和Ampli1技術的整合，以提供樣品到結果的工作流程。

　　該工作流程可以提供具有單細胞分辨率的CTC的分子表征。顯然，評估基因組生物標志物是液體活檢的熱門話題，該工作流程旨在滿足此需求。

　　雖然正在做很多工作來實現循環腫瘤細胞（CTC）用于分子和其他分析的潛力，但捕獲和收獲它們而不破壞細胞仍然是一個挑戰。正在開發解決方案的公司是ANGLE plc。該公司的Parsortix微流體系統目前正在尋求FDA批準，捕獲所有類型的CTC。

　　與CellSearch技術不同，CellSearch技術基于上皮細胞粘附分子（EpCAM）的結合并且不捕獲所有CTC，因為它們不表達必需的細胞表面標記，Parsortix設計能夠捕獲和收獲幾乎所有CTC。

ANGLE的Partsortix系統具有一個一次性盒式磁帶，其大小與顯微鏡載玻片相同，可將活的CTC與血細胞分開

　　該系統使用10-mL血液樣本，其通過Parsortix分離盒。用戶取出10毫升血液管的頂部并將其連接到Parsortix儀器，然后將血液推過顯微鏡載玻片大小的一次性盒式磁帶。較大的，較不可壓縮的CTC輕輕地保持在盒內，而血細胞通過盒子進行廢物處理。

　　一旦分離過程完成，用戶可以用盒內的各種抗體自動染色捕獲的細胞用于檢查，或者它們可以指示系統將細胞收集到系統外用于分子和其他分析。

　　研究者表示：“如果你可以在不損壞樣品的情況下將它們從樣品中取出，那么你可以做很多事情。我們的系統捕獲了血液中CTC的所有不同表型。基于抗體的系統并不能捕獲導致繼發性癌癥的間充質細胞。“

　　女版喬布斯已然宣告破產，但液體活檢這一技術無疑未來可期，我們期待著它能真正轉化到臨床，那將會是歷史性的飛躍。