掃描電鏡中細菌每次脫水用離心嗎

細菌樣品前處理

取液體或固體培養基中培養20h左右、旺盛生長的菌體。

(1)收集菌體:①液體培養基中的菌體,可取培養液8000rpm離心3~5min,棄上清,倒入

2.5%戊二醛固定液;②固體培養基上的菌體,可在菌落表面滴幾滴戊二醛固定液,輕刮菌落(注意不要刮下培養基)。將菌液吸入小離心管,離心后換入新鮮戊二醛固定。

(2)固定,脫水按常規方法。2.5%戊二醛,2~4h→磷酸緩沖液清洗3次→1%鋨酸4~6h→緩沖液清洗3次→乙醇梯度脫水,30%,50%,70%,85%,95%各一次,100%乙醇2次,15~20min/次→乙酸異戊酯置換2次,20min/次(注意:每步均需離心,8000rpm,3~5min,棄上清,倒入下一種試劑,滴管來回吸幾下,打散菌塊)。

(3)臨界點干燥: 普通定性濾紙裁成35mm×18mm的紙條,將長邊35mm平均分成3份,對折成小紙包,用訂書釘將一端訂牢,成小口袋狀。將離心濃縮后的菌液滴入小紙包,立即用釘書器將另一端釘牢。放入臨界點干燥器樣品室,進行CO2臨界點干燥。一般每次可同時處理10~20種不同菌樣(注意,需用液態CO2置換2~3次)。

(4)離子濺射金:沿兩端書釘剪開濾紙包,將干燥后粉末狀純菌體倒入平皿,輕搖盡量分散菌體。碳導電膠帶一面粘在1/4蓋玻片上,另一面倒扣輕壓在菌體粉末上,翻正后用鑷子或牙簽將菌體輕輕刮薄鋪平。離子濺射金后,即可進行掃描電鏡觀察。

細菌樣品特殊制備方法；

1， 固體培養基中的菌體

用鑷子夾一小塊蓋玻片，輕輕放在旺盛生長的菌體上，粘附一定的細菌。然后用雙面膠將此蓋玻片貼在棕色瓶瓶蓋內壁，在棕色瓶內加入適量1%鋨酸，蓋上含有樣品的瓶蓋，熏蒸固定2h以上。然后用雙面膠將蓋玻片粘在樣品臺上，噴金，進行掃描電鏡觀察。 2， 液體培養基中的菌體

取一定的培養液，8000rpm離心3~5min，棄上清液，加入2.5%戊二醛固定2h，pH 7.2磷酸鹽緩沖液清洗，然后加入蒸餾水稀釋，充分混合后用滴管取混合液一滴于小塊蓋玻片上，吸附2min，用濾紙吸去多余溶液。然后用雙面膠將此蓋玻片貼在棕色瓶瓶蓋內壁，在棕色瓶內加入適量1%鋨酸，蓋上含有樣品的瓶蓋，熏蒸固定2h以上。然后用雙面膠將蓋玻片粘在樣品臺上，噴金，進行掃描電鏡觀察。

0.2M 磷酸緩沖液的配制：

磷酸二氫鈉（NaH2PO4.2H2O） 2.94克

磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O） 29克

純水 500mL

pH調至7.4

2.5%戊二醛固定液的配制：

25% 戊二醛 10mL

雙蒸餾水 40mL

0.2mol/L磷酸緩沖液 50mL

戊二醛最終濃度 2.5%

pH值7.3-7.4