掃描電鏡的基本結構和原理

掃描電鏡成像方式與透射電鏡不同，是用電視的方式成像。其基本要點是用極狹窄的電子束來掃描樣品，即電子束在樣品上作光柵運動。電子束與樣品相互作用將會產生樣品的二次電子發射，二次電子能產生樣品表面放大的形貌像，這個像是在樣品被掃描時按時序地建立起來的，即用逐點成像的方法獲得放大的像。

　　一、基本結構

掃描電鏡主要是由電子光學系統和顯示單元組成，它是由電子槍、磁透鏡、掃描線圈以及樣品室組成。電子槍與透射電鏡的電子槍基本相同，只是加速電壓較低，一般在40kV以下。

磁透鏡有第一、二聚光鏡和物鏡，其作用與透射電鏡的聚光鏡相同：縮小電子束的直徑，把來自電子槍的約30μm大小的電子束經過第一、二聚光鏡和物鏡的作用，縮小成直徑約為幾十埃的狹窄電子束。

這是由于掃描電鏡的分辨率主要取決于電子束的直徑，所以要盡可能縮小它，為此，物鏡還裝備有物鏡可動光欄和消散器。一個帶有掃描電路的偏轉線翻通以鋸齒波的電流，產生的磁場作用于電子束使它在樣品上掃描。

掃描電鏡的真空系統也與透射電鏡的真空系統相似，由機械泵、擴散泵、檢測系統、管道及閥門等組成。樣品室位于鏡筒的底部。為了能觀察大塊樣品，樣品室是大于透射電鏡的。與透射電鏡一樣，掃描電鏡的鏡筒也有一套合軸調整裝置，但相對比較簡單。

顯示系統包括信號的收集、放大、處理、顯示與記錄部分。顯示和記錄部分包括兩個顯像管和照相機。一個顯像管是長余輝的，用于觀察;另一顯像管是高分辨率的、短余輝的，用于照相。

　　二、成像原理

從電子槍燈絲發出的直徑20～35μm的電子束，受到陽極的1～40kV高壓的加速射向鏡筒，并受到第一、二聚光鏡 (或單一聚光鏡)和物鏡的會聚作用，縮小成直徑約幾十埃的狹窄電子束射到樣品上。與此同時，偏轉線圈使電子束在樣品上作光柵狀的掃描。

電子束與樣品相互作用將產生多種信號，其中最重要的是二次電子。二次電子能量很低(小于50eV),受到閃爍片上的高壓(＋10kV)的吸引和加速射向閃爍片。閃爍片受到二次電子的沖擊把電子的動能轉變成可見光，光通過光導棒送到光電倍增管，在那里光被高倍放大并轉換成為電流。

這個電信號經過前置放大、視頻放大后，用它去調制顯像管的電子束強度。由于控制鏡筒入射電子束的掃描線圈的電路同時也控制顯像管的電子束在屏上的掃描，因此，兩者是嚴格同步的，并且樣品上被掃描的區域與顯像管的屏是點點對應的。

在樣品上任何一點上的二次電子發射的強度的任何變化將表現為在屏上對應點的亮度的變化，組成了像。可在觀察顯像管的屏上觀察；也可把照相顯像管屏上的像拍攝記錄下來。

掃描電鏡二次電子像的放大倍率由屏上圖像的大小與電子束在樣品上掃描區域的大小的比例決定：M=像的大小/掃描區域的大小。通常顯像管屏的大小是固定的，例如多用9寸或12寸顯像管，而電子束掃描區域大小很容易通過改變偏轉線圈的交變電流的大小來控制。因此，掃描電鏡的放大倍數很容易從幾倍一直達到幾十萬倍，而且可以連續地迅速地改變，這相當于從放大鏡到透射電鏡的放大范圍。

　　三、掃描電鏡生物樣品制備技術

大多數生物樣品具有柔軟且含有大量水分的特點，在行掃描電鏡觀察前，須對生物樣品作相應的處理。由于樣品性質不同，其處理方法和程序也不同。生物樣品主要分兩大類：

①含水量少且質硬的組織，如毛發等，樣品一般含硅質、鈣質、角質和纖維素等成分，通常只需經表面清潔、裝臺（粘膠）、導電處理等簡單過程即可進行觀察。如要觀察其斷面或內部結構時，經斷裂、解剖或酶消化、蝕刻等再裝臺、鍍膜處理，即可進行觀察拍照。

②含水分較多的軟組織，如絕大多數的動植物器官、組織及細菌等。在金屬鍍膜前，須經固定、脫水、干燥等處理，如不經處理或處理不當，就會造成樣品損傷和變形，出現各種假像。

掃描電鏡樣品的處理過程：

主要包括表面清潔、固定、漂洗和脫水等過程，基本上與透射電鏡樣品的處理方法相似,但也有其特殊之處。

1. 樣品大小　所切取樣品比透射電鏡樣品稍大一些，為8～10mm2，高約5mm。

2. 清潔表面　清潔表面并充分暴露樣品表面。常用清洗液有蒸餾水、生理鹽水、緩沖液及含酶的清洗液等。

3. 固定和脫水　常用的固定方法是戊二醛-四氧化餓雙重固定，也可用戊二醛單固定法。

常用脫水劑是乙醇或丙酮。脫水劑濃度梯度增加，從30%或50%開始至100%進行脫水；易變形樣品脫水劑濃度梯度宜緩慢遞增。

4. 樣品的干燥　脫水后，需要將樣品中的脫水劑徹底揮發干凈，即樣品干燥。其方法有：空氣干燥 、真空干燥、冷凍干燥和臨界點干燥。

5. 樣品表面導電處理　用金屬鍍膜法和組織導電處理技術，一是可增強導電能力，消除荷電效應；二是增加樣品表面二次電子發射率，加強訊號，提高圖像反差。

（1）金屬鍍膜：使樣品表面覆蓋薄層金屬膜，這層薄膜與樣品表面的凹凸形態完全一致，使標本表面的形貌得以反映。常用的金屬有金、鉑、鉬、或金/鉑、鉑/銫合金。鍍膜的方法有真空鍍膜法和離子濺射法。

（2）組織導電技術：其目的是為提高導電率克服生物材料的荷電效應，提高樣品表面二次電子發射率。組織導電處理也稱導電染色，是利用某些金屬鹽類能與生物材料中的蛋白質、脂類和淀粉等結合，使樣品表面離子化，使組織導電性增加；并且提高二次電子的發射率。可用醋酸鈾、碘化鉀、丹寧酸等處理標本。