掃描電鏡的樣品制備方法

掃描電子顯微鏡  樣品制備比透射電鏡樣品制備簡單，不需要包埋和切片。掃描電子顯微鏡樣品的制備，必須滿足以下要求：

①保持完好的組織和細胞形態;

②充分暴露要觀察的部位;

③良好的導電性和較高的二次電子產額;

④保持充分干燥的狀態。

某些含水量低且不易變形的生物材料，可以不經固定和干燥而在較低加速電壓下直接觀察，如動物毛發、昆蟲、植物種   子、花粉等，但圖象質量差，而且觀察和拍攝照片時須盡可能迅速。對大多數的生物材料，則應首先采用化學或物理方法固定、脫水和干燥，然后噴鍍碳與金屬以提高材料的導電性和二次電子產額。

化學方法制備樣品

化學方法制備樣品的程序通常是：清洗→化學固定→干燥→噴鍍金屬。

1、清洗：某些生物材料表面常附血液、細胞碎片、消化道內的食物殘渣、細菌  、淋巴液及粘液等異物，掩蓋著要觀察的部位，因而，需要在固定之前用生理鹽水或等滲緩沖液等把附著物清洗干凈。亦可用5%碳酸鈉沖洗或酶消化法去除這些異物。

2、固定：通常采用醛類(主要是戊二醛和多聚甲醛)與四氧化鋨雙固定，也可用四氧化鋨單固定。四氧化鋨固定不僅可良好地保存組織細胞結構，而且能增加材料的導電性和二次電子產額，提高掃描電子顯微圖象的質量。這對高分辨掃描電子顯微術是極端重要的。為增強這種效果，可用四氧化鋨-單寧酸或是四氧化鋨-珠叉二胼等反復處理材料，使其結合更多的重金屬鋨，這就是導電染色。

3、干燥：固定后通常采用臨界點干燥法。其原理是：適當選擇溫度和壓力，使液體達到臨界狀態(液態和氣相間界面消失)，從而避免在干燥過程中由水的表面張力所造成的樣品變形。對含水生物材料直接進行臨界點干燥時，水的臨界溫度和壓力不能過高(37.4℃，218帕)。通常用乙醇或丙酮等使材料脫水，再用一種中間介質，如醋酸戊酯，置換脫水劑，然后在臨界點干燥器中用液體或固體二氧化碳、氟利昂13以及一氧化二氮等置換劑置換中間介質，進行臨界干燥。

4、噴鍍金屬：將干燥的樣品用導電性好的粘合劑或其他粘合劑粘在金屬樣品臺上，然后放在真空蒸發器中噴鍍一層50～300埃厚的金屬膜，以提高樣品的導電性和二次電子產額，改善圖象質量，并且防止樣品受熱和輻射損傷。如果采用離子濺射鍍膜機噴鍍金屬，可獲得均勻的細顆粒薄金屬鍍層，提高掃描電子圖象的質量。

冷凍方法制備樣品

低溫掃描電子顯微術是20世紀80年代迅速發展和廣泛應用的方法。它包括生物樣品的冷凍固定、冷凍干燥、冷凍割斷和冷凍含水樣品的掃描電子顯微術等。

1、冷凍固定：將生物材料投入低溫的致冷劑中，如液氦、液氮、液體氟利昂及丙烷等。快速冷凍可使生物組織細胞的結構和化學組成接近于生活狀態。被冷凍固定的生物樣品，可以在低溫條件下轉移到具有低溫樣品臺的掃描電子顯微鏡   中直接觀察無需進一步處理或僅在冷凍樣品表面噴鍍一薄層金屬。這種方法不僅快速簡便，而且可以排除由于干燥法造成收縮的假象，特別適合于研究含水量很高的生物材料。

2、冷凍干燥：生物樣品經冷凍固定后，其中的水分凍結成冰，表面張力消失;再將冷凍樣品放于真空中，使冰漸漸升華為水蒸氣。這樣獲得的干燥樣品在一定程度上避免了表面張力造成的形態改變。