批量層析方法篩選poly(A)+RNA

總 RNA

吸附 洗滌緩沖液 醋酸銨 乙醇 冰預冷的水 NaCl TES

比色杯 微量離心機 Oligo (dT)18-30—纖維素 旋轉輪 水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

吸附/洗滌緩沖液（含 0.5 mol/L NaCl 的 TES 緩沖液）

醋酸銨（10 mol/L）

乙醇

冰預冷的水

NaCl（5 mol/L）

TES

2. 核酸和寡核苷酸

總 RNA

3. 專用設備

用于測量 260 nm 吸光值的比色杯

有速度控制的微量離心機

Oligo (dT)_18-30—纖維素

旋轉輪

55℃ 和 65℃ 的水浴

二、方法

1. 在一系列滅菌微量離心管中，將每份總 RNA ( 上限為 1 mg ) 樣品的體積用 TES 調整到 600 μl。封好管口，在 65℃ 加熱 10 min，然后迅速在冰上冷卻到 0℃ 。每份樣品加 75 μl ( 0.1 倍體積）5 mol/L NaCl。

2. 在每管中加 50 mg ( 500 μl) 平衡的 oligo (dT)—纖維素，蓋好管蓋，室溫下在旋轉輪上溫育 15 min。

3. 用微量離心機在室溫下離心，600~800 g ( 約 1500~2500 r/min)，2 min。

4. 將上清移到一系列干凈的離心管中，置冰上存放。

5. 在含 oligo (dT) 的沉淀中加 1 ml 冰預冷的吸附/洗滌緩沖液。溫和旋渦震蕩分散沉淀。將蓋好蓋子的離心管置于旋轉輪上，室溫下溫育 2 min。

6. 室溫下，用微量離心機離心，600~800 g ( 約 1500~2500 r/min), 2 min。棄上清。 重復步驟 5 和 6 兩次。

7. 在含 oligo(dT) 的沉淀中加 0.4 ml 冰預冷的雙蒸滅菌水，溫和旋渦震蕩以重懸沉淀。立即在微離心機上離心，4℃，2 min。

8. 小心吸去上清。

9. 回收結合的 poly(A)⁺ RNA：用 400 μl 雙蒸滅菌水重懸沉淀，在 55℃ 溫育 5 min，然后 4℃ 離心 2 min。

10. 將上清移至一系列干凈的離心管中，重復步驟 9 兩次，合并所有上清。

11. 在上清中加 0.2 倍體積的 10 mol/L 醋酸銨和 2.5 倍體積的乙醇，在 -20℃ 存放 30 min。

12. 回收沉淀的 poly (A)⁺ RNA： 4℃ 離心，最大速度，15 min。小心棄上清，用 70% 乙醇洗沉淀，短暫離心，吸去上清，將管蓋打開，倒置數分鐘，使大部分殘留的乙醇揮發。

13. 用小體積滅菌的 DEPC 處理的水溶解 RNA。

14. 估計 RNA 濃度。

15. 保存樣品。