1.培養要分析的細胞。每一個樣品，需要在三角瓶中培養 50~100ml 細胞至 OD600 大約為 1。
2.甲醛處理細胞交聯蛋白質和 DNA。加甲醛到細胞中至終濃度為 1%(37% 的甲醛按 1:36 與細胞懸液混合），在室溫維持 10~120 min，期間顛倒幾次。
>注意：最佳的固定時間對不同的蛋白質是不同的，對于不同的分析要加以優化。
3.制備加有蛋白酶抑制劑的裂解/免疫沉淀緩沖液。使用 5~8 ml 裂解/免疫沉淀緩沖液 (用量根據需要而變化，詳見程序 6 和 7) 來收集每個染色質免疫沉淀樣品。lml 裂解/免疫沉淀緩沖液加 20ul 50 倍的蛋白酶抑制劑儲存液。將緩沖液儲存在冷室中。
>注意：PMSF 最好使用時加入，因其在水相中不穩定，pH 8 時的半衰期約 35 min。每毫升反應緩沖液中加入 20 一 50 倍濃度的蛋白質抑制劑儲存液。
4.停止交聯反應。加入 2.5mol/L 的甘氨酸至終濃度為 125 mmol/L，室溫溫育樣品 5 min 停止交聯反應。
5.用 TBS 洗細胞三次。轉移樣品到 GSA 瓶或 50 ml 聚丙烯管中，收集并清洗細胞。用冰冷的 TBS 洗三次，前兩次用 20 mlTBS 洗，最后一次用少量洗。最后一次洗應該使用 50 ml 管，盡可能去凈 TBS 以便裂解。
6.加玻璃珠裂解細胞。
A. 重懸細胞在裂解/免疫沉淀緩沖液中。在 50 ml 管中用 25ul 冰冷的裂解/免疫沉淀緩沖液重懸細胞。
B. 加玻璃珠（0.5 mm) 振蕩細胞。加 3~6 ml 玻璃珠至重懸細胞（細胞量為 1X109~2X109 個），用旋渦振蕩器以最髙速振蕩細胞。在最初混合裂解物和玻璃珠之后，添加足夠的玻璃珠在混合物中以達到混合物中含有將近 1 ml 的干玻璃珠。這可能需要 1~2 ml 的玻璃珠。在液體相對少的情況下，玻璃珠的研磨作用最好。振蕩每個樣品 6~8 次，每次 30s，或 4、5 次，每次 1min。最好在冷室中完成該步操作。如果在室溫操作，最好間隔地把樣品置于冰上冷凍。
>注意：在顯微鏡下檢測細胞是否有效裂解。如果裂解不完全，視需要重復振蕩程序。
7.收集細胞粗裂解物。加 2~3 ml 新鮮的裂解/免疫沉淀緩沖液，從玻璃珠子上洗凈細胞粗裂解物。收集粗裂解物到一個 15 ml 有蓋的試管中。為了收集裂解物，使用 lml 自動移液器，將移液管尖伸入管底吸取裂解物。反復吸幾次，盡可能吸干凈裂解物。
由于玻璃珠的吸附作用，吸取的裂解物總體積會少于添加時的體積。不用擔心吸走少量玻璃珠，在后面的步驟中殘存的玻璃珠會被去除。
>注意：在吸取樣品或超聲破碎時，不要交叉污染各裂解樣品，因為此后的 PCR 擴增是很靈敏的。
8.超聲粗裂解物剪切染色質。用超聲波處理上清 3 次，每次 12~15s，剪切樣品中的染色質。使用 Branson250 超聲器，用最小的探頭，功率設為 3，100% 的有效循環。
在超聲間隙，至少在冰上冷凍樣品 2 min。超聲后 DNA 的平均長度應為 500bp，分布在 100?lOOObp。
>注意：超聲波處理后檢測 DNA 片段的大小以確定有小的 DNA 片段。為了降低交叉污染，在每個樣品超聲波處理后仔細地清潔超聲探頭。
9.離心去除裂解物中的細胞碎片。在冷凍離心機中 5000r/min 離心幾分鐘，移去細胞碎片。轉移上清到新的 15 ml Corex 離心管中進一步于 4°C 離心 5 min 后，吸去位于 10.75000 處的細胞碎片，并將上清轉移到新管中。重復離心 10 min，再將上清轉移到新管中。最終裂解物應該略呈乳白色。
>注意：在此步驟，可暫時將樣品保存在 -80°C。
10.均化裂解物中的蛋白質的量。對每個裂解樣進行總蛋白質定量。由于樣品較濃，定量時需要作 10 倍的稀釋。加裂解/免疫沉淀緩沖液調濃度，使每個樣品的蛋白質濃度相同用于免疫沉淀。
11.移去總的染色質樣。從各個樣品中移出 50ul 樣，加 20ul 的 TE/1%SDS。這就是總的染色質樣。樣品含有剪切的基因組 DNA，用來判斷免疫沉淀之前的 DNA 的量。不要用這些樣品做免疫沉淀，但是應該對它們進行與免疫沉淀的樣品同樣的操作，為控制 PCR 提供內參 DNA。
12.免疫沉淀選擇的蛋白質。完成三步免疫沉淀，在每個免疫沉淀實驗中使用細胞裂解液應該含有 30 mg 總蛋白質。
預清除：裂解物跟血清孵化除去非專一性結合的抗原。如果可以得到，使用免疫前的血清。若不能得到就使用標準血清。
一抗：添加適當量的抗體到裂解物中，4°C 溫育一至幾個小時。
無抗體免疫沉淀對照：對應每個一抗樣品，做無抗體免疫沉淀對照。這個對照表明玻璃珠或其他因素對非專一性免疫沉淀的水平檢測結果的影響。
二抗：添加 40ul 50% 抗體 A(兔抗）或抗體 G(鼠抗）瓊脂糖珠。4°C 溫育樣品 lh。這是高親和結合程序，延長時間不可能提高免疫沉淀效果。
13.為免疫沉淀后清洗準備含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液。在免疫沉淀后清洗的程序中，每個樣品需要 2 ml 裂解緩沖液和 lml 裂解緩沖液/500 mmol/L NaCl。
14.洗滌免疫沉淀珠子。
A. 去除免疫沉淀上清。3000 r/min 離心 lmin 沉降珠子，去除上清。如有必要可以保存上清以備后面的分析。
B. 按以下程序洗免疫沉淀珠子。在每次清洗后，1000 g 轉速振蕩珠子 lmin(同步驟 13)，用小槍頭移除液體，避免吸到珠子。加 1ml 清洗溶液，室溫洗 3~5 min，重復 3 次。每次洗后，3000r/min 離心去除洗液。清洗步驟如下：
a.用裂解液洗兩次
b.用裂解液/500 mmol/L NaCl 洗一次
c.用免疫沉淀洗脫液洗兩次
d.最后用 TE 洗一次
15.用 TES 洗脫免疫沉淀樣（TE/1%SDS)
a.加100ul TES 在 65°C 溫育 15 min，從抗體珠子上洗脫免疫共沉淀樣。
b.13000r/min 離心，沉降珠子，將上清吸到一個新管子中。
c.再用 150ul TE/0.67%SDS 混合液洗脫一次，上清與第一次的合并。
d.離心上清，將清液轉移到另一只新管子中，以去除殘余的珠子。離心后，能合并上清 250ul，剩余約 10ul 與珠子一起殘留在管底。
16.溫育所有的樣品逆轉交聯。在 68°C 溫育洗脫樣和總的染色質樣，逆轉交聯。
17.用蛋白酶 K 處理樣品。
a.加 TE 到樣品中。交聯逆轉后，加 250ul TE 使總體積為 500ul。
b.加糖原和蛋白酶 K 到各樣品中。加糖原 DNA 擔體和 100 噸蛋白酶 K。
c.37°C 溫育樣品至少 2 h。
18.加氯化鋰。加 55ul 4mol/L 的氯化鋰到樣品中。將使得 DNA 在步驟 22 中沉淀。
19.酚氯仿抽提樣品。用酚氯仿抽提樣品（酚：氯仿：異戊醇比例為 25:24:1) 兩次。
20.DNA 沉淀。
a.加 lml 無水乙醇到各樣品中混合一下。將樣品放人冰箱將有利于沉淀（一般放于一 20°C 或一 70°C) 至少 15 min。
b.12000 g 0°C 離心 10min 沉降 DNA，但若 DNA 濃度過低，可適當延長離心時間。用 75% 乙醇洗沉淀，離心去上清，空氣干燥沉淀。
21.RNase 處理樣品：重懸沉淀在 25~50ul 含 10 ug RNaseA 的 TE 中，37°C 溫育 lh。
22.PCR 分析各樣品。使用專一性引物擴增靶 DNA。同時引入陰性對照。 展開 | 