把色譜柱加熱到80℃會發生什么？

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Proteonavi S5的溶出行為2 & 3

～與他社色譜柱的比較及柱溫80℃下的耐久性及峰形考察～

Keywords :Proteonavi, 肽類, 緩激肽, 后葉催產素, 血管緊縮素II, 神經降壓素, 血管緊縮素I, 環孢菌素A, 表面活性肽, 0.1 vol% HCOOH, 柱溫80℃, 耐久性, 峰形

～與他社色譜柱的比較～

ProteonaviS5是一款以孔徑為30 nm的硅膠作為基材、鍵合C4基團的蛋白質?肽類化合物分析色譜柱。

上回的Espresso中介紹了以6種蛋白質作為樣品，將Proteonavi S5與他社色譜柱進行溶出行為的比較的試驗。（Proteonavi S5的溶出行為1～與他社色譜柱的比較～）

本次，我們以5種肽類化合物（緩激肽、后葉催產素、血管緊縮素II、神經降壓素及血管緊縮素I）作為樣品，將Proteonavi S5與一款填料表面帶有正電荷的他社雜化型色譜柱（孔徑13 nm、粒徑3.5 μm）的溶出行為進行比較，所得結果見圖1。

▲圖1 兩款色譜柱分析所得色譜圖

其中，流動相條件為添加0.1 vol%甲酸的水-乙腈系統，在梯度條件下進行分析，對這兩款色譜柱進行了溶出行為的考察。

如圖1，他社色譜柱對5種肽類化合物的整體保留較弱，且緩激肽峰未能得到確認（被吸附而未能溶出）；與此相對，Proteonavi S5對這5種肽類化合物均得到了良好的色譜峰形及充分的保留與分離。

～柱溫與溶出行為～

對肽類化合物進行分析時，有提高柱溫的做法。例如，《第17改正日本藥局方》中，環孢菌素是在柱溫80 ℃附近的一定溫度下進行分析的。

在此，以環孢菌素A作為原料，在等度條件下對色譜柱柱溫變化及相應的溶出行為進行了考察。圖2為所得結果。

環孢菌素A (M.W. 1202.6)

Cyclosporin A

▲圖2 柱溫與環孢菌素A溶出行為的關系

如圖2，隨著柱溫的上升，環孢菌素A的保留逐漸減弱，峰形也愈發尖銳。

一般，與小分子相比，大分子的擴散速度較慢，因此色譜峰形有展寬的趨勢，而設定較高的柱溫可以使峰形變得尖銳。

就像這樣，常規情況下，在對肽類化合物進行分析時，設定較高柱溫可以使分析時間縮短，并提高定量準確性。（敲黑板！）

～80℃下的耐久性考察～

接下來，在柱溫80 ℃條件下對Proteonavi S5的耐久性進行了考察。

圖3為首次進樣與連續進樣第500針所得色譜圖，圖4為進樣500針的環孢菌素A保留時間維持率（％）。

▲圖3 首次進樣和連續500次進樣所得色譜圖

▲圖4 環孢菌素A的保留時間維持率（％）

如圖3、4，對Proteonavi S5進行80?C條件下的連續耐久性試驗，在連續500次進樣過程中（通液時間共計250小時），環孢菌素A的峰形幾乎沒有變化（理論塔板數N及對稱因子S），同時，保留時間維持率近乎100%（首次進樣與第500次進樣對比，具體數值為99.4%）。

綜上，Proteonavi S5色譜柱即使在80 ℃的高柱溫條件下也能得到非常穩定的分析結果。

對于環孢菌素A這樣的大分子化合物，隨著柱溫的上升，其擴散速度加快，因而峰形會更尖銳。

進一步，針對提高柱溫的效果，以環狀肽類化合物表面活性肽（M.W. 1036.3）作為分析對象，將柱溫分別設定為40 ℃和80 ℃進行分析，圖5為分析所得結果。

表面活性肽 (M.W. 1036.3)

Surfactin

▲圖5 柱溫40 ℃及80 ℃條件下

對表面活性肽的分析色譜圖