抗體的純化實驗

抗體溶液

蛋白 A- 或 G-瓊脂糖Tris-HClNaCl

親和柱

1. 建議從商業提供的蛋白 A- 或 G-瓊脂糖開始。如從蛋白 A 或 G 偶聯到介質開始，則偶聯到溴化氰活化的瓊脂糖的方法前面；

2. 蛋白 A- 或 G-瓊脂在起始緩沖液（100 mmol/L，pH 7.5 Tris-HCl，100 mmol/L NaCl） 內室溫放置 30 min。每 g 介質約用 10 ml 緩沖液。水合作用期間干介質體積將溶脹 3～4 倍，此后步驟如不注明均在室溫下進行；

3. 溶脹后的介質在起始緩沖液內裝柱。再用 5～10 倍體枳同樣緩沖液洗柱，建議最大流速為 1 ml/min；

4. 3～5 倍體積 0.1 mol/L，pH 2.5 glycine-HCl 洗柱。洗去可能存在的污染物；

5. 再用 5～10 倍體積起始緩沖液平衡柱。若欲存放則應用含 0.02％ NaN₃ 的起始緩沖液平衡，然后 4℃ 保存；制備抗體溶液

6. 抗體樣品液離心 10 000×g，10 min，除去沉淀；

7. 用等體積起始緩沖液稀釋樣品，或加入 1/10 體積 10× 起始緩沖液，以獲得適當的 pH 和離子強度；

8. 上樣，即將緩沖好的樣品液加到親和柱內。每 ml 溶脹介質可以上樣 2 ml 多克隆抗體血清或 20 ml 單克隆抗體上清。通常上樣的總 IgG 量應略低于柱總結合容量的 80％，每 ml 溶脹介質能結合 5～20 mg IgG；

9. 在洗脫前，用 10 倍體積起姶緩沖液洗柱。讓 A₂₈₀ 值恢復到基線或本底水平；

10. 用 5～10 倍體積 0.1 mol/L glycine-HCl（pH 2.5） 緩沖液洗脫結合的抗體。洗脫液以 1 ml 為洗脫組分分部收集，收集試管含 0.1 ml 1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）緩沖液以便及時中和低 pH；

11. 匯集 A₂₈₀ 大于等于 0.2 的峰組分；

12. 若需除去鹽分或改變緩沖液，可以在磷酸緩沖鹽液（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KC1，6.5 mmol/L Na₂HPO₄）中透析，或過凝膠離心柱，或用超濾的方法；

13. 以 1 ml 為單位分裝，近期用的存放 4℃， 長期儲存放 -20℃；

14. 親和柱用 5 倍體積 0.1 mol/L glycine-HCl（pH2.5）洗脫液再次洗后，用 10 倍體積起始緩沖液平衡，即可再次使用。如欲存放，用含 0.02％ NaN₃ 的起始緩沖液平衡后 4℃ 保存。

與蛋白 A 或 G 結合的抗體最常用低 pH 溶液洗脫。應該注意在酸性條件下抗體不太穩定，較好的辦法是用緩沖能力強的中性溶液收集洗脫組分。使目的抗體洗脫后很快進入中性環境，以免失活。