不管是制備單抗還是多抗，抗原的設計與制備都是一個非常重要的問題，設計或者制備得不好的抗原有可能完全不能免疫出抗體來。一個良好的抗原必須具體的條件：（1）分子足夠大。對于多肽或蛋白質類的抗原來說，一個抗原決定簇（又叫表位，epitope），通常由6-8個氨基酸殘基組成。而平均每5-10kD才有一個表位，因此分子太小的多肽或蛋白是很難有一個表位的。（2）外源性強。在個體形成的早期就對自身物質形成了免疫耐受，因此如果和機體內的物質完全一樣或者是相似就很難引起機體的免疫應答。如果是利用免疫赦免區的成份（如大腦、眼球、睪丸內部成份）則不必考慮外源性。（3）結構盡量復雜。簡單重復的物質是不具有免疫原性的，拿明膠來說，它的分子量非常大，而且外源性也很強，但是組成明膠的氨基酸多為直鏈氨基酸，在體內容易被降解，因此它的免疫原性很弱。類似地，淀粉、核酸、多聚Lys的免疫原性也很弱。（4）可降解性好。作為抗原，必須是可以降解的，塑料、不銹鋼等難降解的物質免疫原也很弱。由D-型氨基酸組成的物質免疫原性也很弱，同樣是因為機體不能降解D-氨基酸組成的蛋白或多肽。常用的抗原可以通過以下方式制備：
（1） 純化的天然蛋白質。 由于天然的蛋白存在修飾，而且結構比較復雜（除了線性表位還有結構表位），因此天然的蛋白質是很好的抗原。但是天然的蛋白很難達到較高的純度，這給免疫和后面的純化帶來了不少麻煩，而且只適合在機體細胞內表達量比較高的蛋白。有一個很典型的例子就是大家使用的二抗，就是從一種動物血清中分離出抗體，然后用它作抗原（有的需要酶解分離出重鏈和輕鏈）免疫另一種動物。站長準備寫一篇文章專門討論一下天然蛋白的純化，敬請期待！
（2）純化的重組蛋白。相對于天然蛋白來說，重組蛋白比較容易獲得得較高的純度，而且鑒定也比較方便，整個生產過程更容易掌握。相信大家都做過重組蛋白，所以關于純化我就不多說了，值得注意的是重組蛋白為了純化的方便，通常需要帶一段標簽（如GST、6*His、Myc、MBP、Flag、Fc等)，在免疫中動物體通常會產生這些標簽的抗體，在后面的純化過程中需要去掉這些標簽的抗體，比如說可以使用對應的另一種標簽的重組蛋白純化抗體，或者先用純標簽蛋白吸附掉血清中的標簽抗體，然后再用重組蛋白純化目的抗體。6*His這個標簽比較小，而且免疫原性弱，因此由它產生的抗體幾乎可以忽略，如果用它作為重組蛋白標簽就不需要考慮去掉由標簽產生的抗體。另外，重組蛋白因為不存在修飾，也不存在高級結構，因此最終生產出來的抗體可能無法識別天然蛋白，難以用于某些實驗。如果你怕麻煩不想生產蛋白，你可以去看看市場上有沒有制備好的蛋白，這樣可以節省不少時間和精力。推薦大家去Proteintech Group公司網站上看看www.ptgcn.com，他們擁有上萬種蛋白可供選擇，而且跨國生產，國內國外產品保持同步。
（3）人工合成多肽。很多蛋白屬于家族蛋白，而這些家族內的蛋白相似度都很高，以Actin（肌動蛋白）家族來說，alpha-actin、beta-actin、gamma-actin之間的相似度都很高，相互之間只相差幾個氨基酸，另外，不行物種之間的Actin同源性也極高，此時如果用對應的天然蛋白或者重組蛋白免疫動物往往不能產生出抗體，或者生產的抗體可以同時識別這三種肌動蛋白，此時最好的解決辦法就是人工合成它們之間不相同的區域作為抗原進行免疫。值得注意的是，根據前面說的，如果分子太小是很難引起機體發生免疫反應的，所以合成好多肽后還需要將多肽連在一個大的載體上以增加其免疫原性，常用的載體有：BSA（牛血清白蛋白）,RSA(兔血清白蛋白),HSA（人血清白蛋白），OVA（卵清蛋白），GST（谷胱甘肽S轉移酶），KLH（Knoweyhole Limpet Hemocyanin，鑰孔戚血藍蛋白），MAP（多價抗原肽，主要指多聚Lys）。設計抗原時還需要注意：(a)序列上的外源性。設計的多肽序列不能在被免疫的動物體內存在相同的序列，否則你的多肽的部分很難引起免疫反應。關于同源性，可以用Blast去查一下。（b)親水性。蛋白質總是傾向于將親水部分暴露在外而將疏水部分隱藏在內部，因此設計的多肽應該盡量親水以便更好地引發免疫反應。DNassist，GCG，ProtScale等軟件都可以對多肽序列的親水性進行預測，關于軟件的使用請大家自己學習。（c)N端與C端的選擇。一般來說末端的肽段比中間的肽段好（暴露充分），對于膜蛋白來說，C端疏水性比較強，宜選擇N端。（d）氨基酸的各類。序列中不能含有太多的Pro（脯氨酸),一般可以含有1-2個Pro。另外，盡量包含MHCⅡ 類分子偏好的氨基酸Asp，Tyr，Phe，同時避免容易發生糖基化和磷酸化的位點的氨基酸。(e)為了偶聯載體，通常需要多加一個氨基酸作為“橋”，目前用得比較多的是Cys，它應該加在對抗體產生不重要的那一端。(f)多肽的長度。為了能夠達到一個表位的跨度，設計的多肽不能少于6個氨基酸，通常的要求是8-20個氨基酸，如果設計的多肽太長則可能會形成二級結構，同時合成多肽的成本也比較高。
（4）小分子物質。主要是小分子藥物，分子量一般不超過1000Da，分子量小于300Da的分子很難獲得高親和力的抗體。含有芳香環的小分子更容易引起免疫反應，但是和人工和成的肽一樣，小分子藥物也屬于半抗原，也需要連接載體才能夠進行免疫動物。關于小分子連接載體的理論，和多肽連載體的原理基本一樣，值得注意的是，連接載體的時候要注意主要官能團不能參與偶聯或被隱藏。這個網站包含了常見的小分子結構與性質：http://www.imtech.res.in/raghava/haptendb/另外這個網站上還有很多半抗原的抗體，并描述了其制備方法，可以參考一下。另外還推薦一本書：李俊鎖主編的《獸藥殘留分析》，上海科學技術出版社出版。
（5）組織、全細胞或細胞組分。當我們不清楚自己需要的抗原，比如說想制備出腫瘤特異性抗原的抗體的時候，往往需要以組織、全細胞或者細胞組分作為抗原進行動物免疫。如果以組織作為抗原，則需要切除新鮮的組織，用生理鹽水洗干凈，然后用濾網和研杵將其分離成單個細胞。 如果是以全細胞作為免疫原，則需要洗去培養基中的血清，建議直接以完整的細胞作為免疫原而不將其破碎，因為完整的細胞具有更強的顆粒性和外源性。組織來源的細胞和人工培養的細胞作為免疫原時宜用腹腔免疫的途徑進行動物免疫，而不建議用皮下免疫。對于細胞組分作為抗原，重點則在細胞組分的分離上面。細胞膜和細胞質的分離可以采用低滲法（只需要配一個低濃度的緩沖液，另外加入MgCl2可以穩定細胞核使其不破碎），也可以加入Ca2+進行勻漿，然后再離心，細胞膜就在下面形成沉淀。細胞內部細胞器的分離則主要依靠密度梯度離心了。有些細胞器的密度相差比較近，因此可能需要更細的密度梯度離心。有時候也可以采用一些特別的方法進行輔助，比如說有位仁兄寫了一帖叫“從純化到星辰”的提到，線粒體和過氧化酶體沉降系數很接近,用密度梯度離心的方法不太容易分開，于是可以往老鼠體內注射Triton WR1399,這種去垢劑不能被老鼠代謝掉而積累在肝臟的線粒體內，于是這時候的線粒體密度就變小了，便容易與過氧化物酶體分開了。有關利用細胞進行動物免疫的資料大家可以參考一下張學光和金伯泉以及他們學生的文章。
不管是哪一種方式的抗原，純度都是越高越好，純度越高，非目的性的免疫反應就小，目的抗體在抗血清中占的比例也就越高。最后需要注意的是，作為抗原，不能有太強的毒性，否則動物會死亡。通常在抗原制備中經常會用到去垢劑，但是免疫動物之前必須確保不含去垢劑，否則很容易引起動物死亡的，尤其是采用靜脈加強免疫時，很低濃度的去垢劑就能引起動物的死亡。