抗原呈遞細胞的選擇和制備

基本方案 過 利 斯 特 氏 菌 刺 激 制 備 腹 腔 巨 噬 細 胞

材 料

單核細胞增多性利斯特氏菌

無 菌 PBS

H -2 相 合 小 鼠（見 表 A .2A .1)，包括正常和提前 3 周注射了利斯特氏菌的小鼠

V冰浴的 D M E M 培養基

3 % (V A O 乙酸

0.4% (m /V ) 臺盼藍染液

V D M E M -1 0 完 全 培 養 基（室溫以及 37°C )

7 0 % (V7 V ) 乙醇

IOml 和 30m l 的注射器以及 23 G 針頭

離心機
9 6 孔培養板

移液器

顯微鏡

1 . 在 50m l 離心管內將利斯特氏菌用 P B S 稀釋至合適濃度，此 時 0.5?1.0m l 菌液中含半數致死量 5 % ?1 0 % 的 細 菌（一 般 情 況 下 C B A /J 小 鼠 或 C 57B L / 6 小 鼠 需 IO⁵ 個細菌/m l ， B A L B /c 小鼠需 IO⁴ 個細菌/ml)。蓋緊離心管蓋后搖勻。用 IOml 注射器抽取稀釋過的上清。

2 . 用 23 G 針 頭 將 0.5?1.0m l 細菌懸液注射人 H -2 相合小鼠腹腔。根 據 步 驟 6 計算出制備足夠用細胞所需小鼠數量。

3.7?Ild 后 收 集 腹 腔 細 胞（單 元 6.1)。用 冰 浴 的 D M E M 收集細胞以防止巨噬細胞黏附在管壁上。

4 . 將收集的細胞懸液置于 50m l 離心管， 4°C ， 400?500 g 離 心 lOmin，收集細胞并重懸于 0.5m l 預 冷 的 D M E M 中。

5 . 吸取少量細胞懸液并以 1 : 5 (W F ) 懸 浮 于 3 % 的乙酸溶液中，以溶解紅細胞。加入等量的臺盼藍染液并計數活細胞（見 附 錄 3C ，細胞數量應達到 I X l O ⁷?2 X 10⁷ 個
細胞/ml)。

6 . 在離心管內加入 D M E M -1 0 完全培養基，將細胞濃度調節至 2X 10⁶個細胞/m l 。如果血清濃度達不到 8 % ?9 % ，可離心細胞棄上清后直接用 D M E M -I O 完全培養基稀釋
至 2 X 10⁶ 個細胞/ml。將腹腔細胞轉移至 9 6 孔培養板培養， IOUl/孔（2 X 10⁵ 個細胞/孔）。

7.37°C 培 養 2 h 或 稍 長 時 間（但不可過夜）以便巨噬細胞貼壁。

8 . 用多道移液器反復輕柔地吹打細胞，吸棄懸浮細胞后加入 37°C 預 熱 的 D M E M -I O 完全培養基。注意操作宜輕柔且不能觸碰到貼壁細胞。

9 . 在顯微鏡下檢查細胞。分離的細胞若在 I d 內使用，就無需用 IFN-7 進一步活化。

備 選 方 案 1 連續注射利斯特氏菌和豚蛋白胨后制備腹腔巨噬細胞

此法可以較前法制備更多數量的小鼠腹腔巨噬細胞，但需要給小鼠多注射一次，且需要在更短的時間內收集巨噬細胞。此過程與前述基本方案基本相同，只是在初次注射細 菌 7?IOd 后 ，直接給小鼠腹腔一次性注射 I m l 高壓滅菌消毒的溶解于水的 1 0 % (V /V )豚蛋白胨。 3d 后如前述收集細胞（見基本方案，步 驟 3?9)。

輔 助 方 案 1 小鼠腹腔注射用利斯特氏菌的制備

材 料

4 只 小 鼠（如 C B A /J)

培養單核細胞增生性利斯特氏菌（見 單 元 6. 6)

無 菌 PBS

I O O m m 無菌腦心浸液瓊脂板

無菌腦心浸液培養基

細菌凍存液：溶 解 于 P B S 的 2 0 % (V /V ) 甘油，蒸汽消毒后 4°C 保存

70um 無菌尼龍濾網

50m l 離心管

無菌細菌涂布器

37°C 培養箱

無菌接種環

560n m 分光光度計

高速離心機以及無菌帶蓋離心管

Sorvall R C -5 離心機及 G S A 轉子

I m l 凍存管

1 . 將適量利斯特氏菌注射至 2 只小鼠腹腔，以便通過體內途徑獲得利斯特氏菌并確保其毒力。如 對 于 C B A / J 小 鼠 ，可 使 用 IO6 個細菌/鼠。 2d 后處死小鼠，取出脾臟并制備脾細胞懸液，通 過 70 Mm 無菌尼龍濾網后將細胞置于 50m l 離心管。另 取 2 只小鼠作為對照。

也可以不通過體內傳代，直接從腦心浸液瓊脂板挑取利斯特氏菌克隆，參照步驟 3 接種至腦心浸液肉湯。

2.用 P B S 梯度稀釋脾細胞懸液（1 : 10、 1 : 100、 1 : 1 0 0 0 ) 并 將 IOOm I 各組稀釋細胞懸液分別置于 I O O m m 無菌腦心浸液瓊脂板，用無菌細菌涂布器將細胞涂布均勻。置于 37°C 培養箱培養過夜。計數每塊培養板的克隆數。確認涂布對照小鼠脾細胞板不形成克隆，且涂布實驗小鼠脾細胞板形成大量克隆（對 于 1 : 1 0 0 稀釋的細胞，每塊培養板應獲得 10?100 個克隆）。

3 . 用接種環從培養板挑取 4 個 典 型 克 隆 并 分 別 轉 移 至 20m l 無菌腦心浸液培養基中(50m l 離心管）。注意每次挑取克隆時接種環均需滅菌。加蓋混勻。

4a. 制備當天細菌培養物：將 試 管 置 37°C 培養，每 30m i n 搖動一次。 3 h 后 ，定 時（比如每小時）取少量菌液通過分光光度計檢測其 O D 值 。當 O D 值均達到 0.17 時停止培 養（約 需 4 h)，從中取一管再擴增。

4b. 制備隔夜細菌培養物：將 試 管 于 37°C 靜 置 培 養 過 夜（試管蓋無需蓋緊）。第二 天 ，將試管內的菌液以 1 : 1000 稀釋至無菌腦心浸液培養基，培 養 至 O D 值 達 到 0.5?1.0 (約需 8 h)。

5 . 將菌液置 4°C 保 存（每 份 0.5 ml)。如方便，可于第二天確認培養物中是否含有利斯特氏菌。此外 ，利斯特氏菌能在 4°C 存活并擴增。對于隔夜培養的細菌，進 入 步 驟 7操作。

6 . 經過篩選后，將含有細菌的 15?130m l 腦心浸液培養基轉移至無菌高速離心管，將其固定在搖床的樣品架上，在 37°C 緩慢搖動培養，定時檢測 O D 56c 5 值 ，并 在 O D 56。值達 到 0.5?L O 時 停 止 培 養（約 需 5 h)。

7.700g離 心 細 菌 6 min。在此過程需非常小心：因為培養物里含有大量細菌。將細菌懸 浮 于 IOml 凍存液中。

8 . 檢測細菌的 O D 56。值（可 通 過 1 : 2 0 稀釋后檢測），將細菌的濃度調節至 I X l O⁷?IO⁸個細菌/ml (O D 56。值 為 1 時細菌量約為 5 X 10⁸)。將 細 菌 分 裝（0.1?Iml) 保存于一80°C ，可以保存 3 年以上。每次解凍后使用，應避免反復凍融。

備 選 方 案 2 Con A 刺激的腹腔巨噬細胞的制備

此方案中不使用致病菌，但巨噬細胞獲得率較低。將 Con A 溶 解 于 PBS (200ul/ml) ，用 0.22/xm 的濾器過濾，然后保存于 一 20°C 。 每只小鼠腹腔注射 500ul (IOOug)C o n A (附錄 2E ) ， 4d 后收集腹腔巨噬細胞（見基本方案，步 驟 3? 9) 。

備 選 方 案 3 骨髓來源的巨噬細胞的制備

附 加 材 料

10% ( V A O L929 細胞條件培養基（見輔助方案 2)，溶解于 D M E M -10 完全培養基

0.05% (V /V ) 胰蛋白酶/0.53m m o l / L E D T A

100U/ml (lOng/ml) 重組小鼠 IFN- 7 , 溶 解 于 l 〇 % L 929 條件培養基

5m l 注射器和 25 G 針頭

I O O m m 無菌培養皿

IOml 無菌吸管

70p m 無菌尼龍濾網

細胞培養皿和培養瓶（可選用）

9 6 孔平底培養板或 2 4 孔培養板或 I O O m m 細胞培養皿

1 . 處 死 小 鼠（附 錄 2 G )，取出股骨并去除肌肉（單 元 6.1)。

2.剪斷股骨，通 過 5m l 注 射 器 和 25 G 針 頭 用 4 ml 1 0 % L 929 條件培養基沖洗出骨髓，將骨髓收集至無菌 I O O m m 細胞培養皿。

3 . 用 IOml 無菌吸管反復吹打細胞團塊，將細胞懸液通過 70 Mm 無菌尼龍濾網。

4.取部分細胞懸液以 1 : 5 懸 浮 于 3 % 乙酸，以溶解紅細胞。加 入 等 量 的 0 . 4 % 臺盼藍染液計數活細胞。據此 用 1 0 % L 929 條件培養基調節細胞濃度至 IO6 個細胞/ m l 。

5a 擴增細胞：將細胞置于培養皿或培養瓶中培養 7d ，用 0.05% (V A O 胰蛋白酶/0.53 mmol/L E D T A 消化，收集細胞并以 5 X IO⁴?IO⁵ 個細胞/孔 置 于 9 6 孔培養板
中培養。

5b. 不擴增培養：將細胞置于培養板：

9 6 孔培養板： 0.2m l 細胞懸液/孔

2 4 孔培養板： I m l 細胞懸液/孔

I O O m m 培養皿： 12m l 細胞懸液/個

6.對于擴增的細胞，繼續培養 1?2d 直至細胞匯合。對于未擴增培養的細胞需培養 5?7d ，用 1 0 % L 929 條件培養基每 2 天換液。

7 . 為了增強抗原呈遞效率，可在抗原呈遞實驗前 4 8 h 用 l O O U / m l 溶 解 于 1 0 % L 929 條件培養基的重組小鼠 IFN-y ( l O n g / m l ) 處理細胞。

輔 助 方 案 2 制 備 L9 2 9 條件培養基

材 料

貼壁培養 L 929 細 胞（A T C C 細胞株號 C C L l )

V 無 菌 P B S ，室溫

0 . 0 5 % (W V ) 胰蛋白酶/O.53 mmol/L EDTA

V D M E M -IO 完全培養基

15m l 離心管

Sorvall RT- 6 0 0 0 冷凍臺式離心機及 HB-IOOO 轉子

培養瓶

0.45um 濾膜

1.在 25 cm2 培 養 瓶 中 培 養 L 9 2 9 細 胞 ，當細胞處于對數生長期并匯合生長時吸棄上清(10 ml)。加 入 3m l 室 溫 無 菌 P B S ，搖 動 培 養 瓶 后 靜 置 lmin，輕輕搖動一次后吸棄 P B S 。

2.加入 3m l0 . 0 5 % (V /V ) 胰蛋白酶/0.53 mm 〇 l/L E D T A 靜 置 5 min。 蓋緊瓶蓋，拍打培養瓶使細胞脫落，也可在顯微鏡下觀察細胞脫落情況

3 . 加 入 IQml D M E M -I O 完 全 培 養 基 并 將 細 胞 懸 液 轉 移 至 15m l 離 心 管 ， 4°C ， 400?500 g 離 心 lOmin，吸棄上清后，將細胞懸浮于和原培養基等量的 D M E M -10 完全培養基中。

4 . 將細胞懸液用 D M E M -I O 完全培養基作 1 : 1 0 (W V ) 稀釋并轉移至適當大小的培養 瓶 中（0.4m l 細胞懸液/c m 2 培養瓶）。繼 續 37°C 培養直至細胞匯合，一般需要一周 。

5 . 收集細胞上清，用 0.45p m 濾膜過濾并分裝成每份 1?15m l ，置一 20°C 凍存。

備 選 方 案 4 制 備 LPS 刺 激 的 B 細胞

材 料

懸 浮 于 D M E M -I O 完全培養基中的脾臟細胞懸液（單 元 2. 1)

x/ D M E M -10 完全培養基， 37°C

LPS (如 Difco 或 Sigma)

I O O m m 細胞培養皿

50m l 無菌離心管

Sorvall R T - 6 0 0 0 冷凍臺式離心機及 H B - I O O O 轉子

75 cm2 細胞培養瓶

1 . 用 A C K 紅 細 胞 裂 解 液（單 元 2 . 1 ) 去除脾細胞懸液中的紅細胞。

2 . 將細胞懸浮于 D M E M -I O 完全培養基，計 數 活 細 胞（附 錄 3 0 , 調節細胞濃度至 5 XIO⁶個細胞/ml。

3 . 將細胞轉移至 I O O m m 細 胞 培 養 皿（IOml/培養皿）中，并 在 37°C 培 養 2 h ，輕輕搖動培養瓶后，將懸浮細胞轉移至 50m l 離心管。

4 . 室溫， 200?300 g 離 心 lOmin，吸棄上清，將細胞再次懸浮于預熱的 D M E M -I O 完全培養基，計 數 細 胞（附 錄 3 0 , 調節細胞濃度至 2 X 10⁶ 個細胞/m l 。

5 . 加 入 L P S 至終濃度 10 Mg/m l 。將細胞懸液轉移至 75 cm2 細胞培養瓶或 I O O m m 細胞培養皿 ， 37°C 培 養 48 h 。

6 . 輕輕搖動培養瓶使非貼壁細胞懸浮，將細胞懸液轉移至 50m l 離心管， 200?300 g 離心 lOmin，吸棄上清，將細胞再次懸浮于 D M E M -1 0 完全培養基。

7.200?300 g 離 心 lOmin，吸棄上清，將細胞再次懸浮于預熱的 D M E M -1 0 完全培養基 ，計數細胞，調節細胞濃度至 2 X 10⁶個細胞/m l 。這些細胞就可用作非貼壁的抗原 呈 遞 細 胞（單 元 7. 2)。