實驗方法原理
首先通過逆轉錄病毒介導的轉基因（用于組成型表達）或四環素調控的系統（用于可誘導表達）建立表達抗原決定簇標記的蛋白復合體亞基的穩定細胞系。然后用抗原決定簇特異的單克隆抗體偶聯的小珠進行免疫親和純化，以沉降抗原決定簇標記的多亞基蛋白復合體。最后在中性 pH 或生理條件下洗脫回收，即可用于功能試驗。
實驗材料 FLAG 標記蛋白的編碼序列逆轉錄病毒載體50% 匯片的 HeLa 細胞逆轉錄病毒包裝細胞
試劑、試劑盒 HEPES 緩沖鹽（HeBS） CaCl2甘油／DMEMDMEM（含 FBS）聚凝胺儲存液含有藥物的選擇培養基胰酶-EDTAPBSSDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液抗 FLAG M2 單克隆抗體 Joklik 培養基（含小牛血清）抗 FLAG M2 單克隆抗體偶聯的小珠BC100諾乃洗滌劑 P-40FLAG 肽液氮
儀器、耗材 5 ml 圓底 Falcon 試管60 mm 和 100 mm 組織培養皿15 ml 無菌試管 0.45 μm 醋酸纖維素注射過濾器24 孔組織培養板1.5 ml 和 0.5 ml 微量離心管250 ml、500 ml、1 L、3 L 和 12 L 旋轉搖瓶 試管旋轉儀轉子微量離心柱
實驗步驟
1. 將 FLAG 標記蛋白編碼序列克隆到含有藥物篩選標記（如新霉素）的逆轉錄病毒載體。
2. 轉移 20 μg 到 5 ml 圓底 Falcon 試管中并與 0.5 ml 2 × HeBS，pH 7.12 混合。
3. 逐滴加入 0.5 ml 0.25 mol/L CaCl2 同時渦旋混勻。室溫放置 20～30 min。
4. 激烈渦旋混勻 DNA-磷酸鈣共沉降物，將混合物加入 50% 匯片的 ψ CRIP 細胞，這些細胞用含 10% 小牛血清的 DMEM 培養在 100 mm 組織培養皿中。37℃，5% CO2 培養 3 ～4 h。
5. 移出培養基加入 3 ml 15%（V/V）甘油/DMEM，室溫放置 3 min。
6. 加入 8 ml DMEM 以快速稀釋甘油，混勻，然后移出溶液。
7. 重復洗滌 3 次，每次用 3 ml DMEM。
8. 加入 10 ml 含 10% 小牛血清的 DMEM 至轉染了的細胞，37℃、5% CO2 培養 18 h。
9. 用 0.45 μm 醋酸纖維素注射濾器過濾細胞培養上清液（甘油休克 18 h 后）以去除懸浮細胞和大的細胞碎片，將病毒顆粒收集于 15 ml 無菌試管。
10. 用 1 ml 含 10% FBS 的 DMEM 和聚凝胺（終濃度為 8 μg/ml）與 1 ml 過濾后的病毒儲液混合。混合物與 50% 匯片的 HeLa 細胞在 37℃ 共孵育 2.5 h，間歇混合。這些細胞用含 10% FBS 的 DMEM 培養于 100 mm 細胞培養皿中，并且用培養基預洗了 2 次。
11. 額外加入 8 ml 含 10% FBS 的 DMEM，不要移除起初轉染的培養基，37℃ ，5% CO2 培養 1～1.5 天。
12. 分出 1/5 的細胞到含有藥物的培養基，每 3～4 天更換選擇培養基。抗性克隆通常 2～3 周后可見。
13 . 準備一個 24 孔板，隔一個孔加入 2 滴（約 100 μl）胰酶-EDTA 以避免相鄰孔之間的交叉污染。
14. 用黑色（或藍色）記號筆把將要挑出的藥物抗性克隆用圓圈圈出（直徑為 2～3 mm）。移除培養基，用 1 × PBS 洗滌細胞 1 次，然后移除溶液。
15. 用 200 μl 吸頭從第一個孔取約 50 μl 胰酶-EDTA，在圓圈圈住的克隆處吸打數次后轉移回第一個孔。
16. 重復轉移總共 12 個克隆。
17. 每一孔加入 1～2 ml 選擇培養基。將 24 孔細胞培養板放回 37℃，5% CO2 培養箱使細胞貼壁生長。基于轉移的活細胞數，孔內細胞匯片可能需要 3～14 天。
18. 當 24 孔板中的細胞匯片時將其轉移至一個 60 mm 的細胞培養皿中以繼續單個細胞克隆的擴增。
19. 當細胞在 60 mm 細胞培養皿中接近匯片的時候，再次將細胞分到一個 60 mm 細胞培養皿和兩個 100 mm 細胞培養皿中。在 100 μl 細胞培養皿中培養的細胞將要凍存為單獨的克隆化細胞系。
20. 在用 1 × PBS 洗滌 2 次過后，加入 300 μl 1 × SDS 聚丙烯酰胺蛋白上樣緩沖液至生長在 60 mm 細胞培養皿中達到 80%～90% 匯片的細胞中，以制備總細胞裂解液。用槍頭多次吸打裂解液直到樣品沒有黏性，然后將樣品轉移至 1.5 ml 微量離心管中。
21. 用抗 FLAG M2 單克隆抗體和（或）抗蛋白抗體對每個收集到的總細胞裂解液進行免疫印跡以鑒定表達 FLAG 標記蛋白的細胞克隆。
22. 通過調整至懸浮培養的方法，選擇一個表達 FLAG 標記蛋白的陽性克隆做進一步擴增。合并 12 中 100 mm 細胞培養皿的細胞至一個 250 ml 旋轉搖瓶中，用含 10% FBS 的 Joklik 培養基將細胞密度調整至 0.5 × 106 細胞/ml。使細胞以同樣的密度在含 10% FBS 的 Joklik 培養基中保持 3 天以上。如果細胞健康并且接近指數增長，則開始用含 10% 小牛血清的 Joklik 培養基培養細胞。繼續用含 10% 小牛血清的 Joklik 培養基培養細胞至少 3 天。如果細胞仍然看起來健康并且生長旺盛，則開始用含 7.5%（或 5%）小牛血清的 Joklik 培養基培養細胞。
在擴增和血清轉換/減少的過程中，如果細胞看起來不健康或細胞密度減少，將細胞 300 g 離心 5 min，用含相同濃度小牛血清的新鮮知 Joklik 培養基重懸，這能幫助去除細胞碎片。重新調整細胞密度至 0.5×106 細胞/ml。一旦細胞健康且繼續生長就開始按前述方法降低血清的濃度。重復這個過程直到細胞維持于含 5% 小牛血清的 Joklik 培養基中。
23. 連續培養和擴增生長在含 5% 小牛血清的 Joklik 培養基中的細胞至 20 L 或其他想要的體積。
24. 按照 12.1制備核抽提物、細胞質 S100 和核丸（或染色體組分）。
25. 用免疫印跡來識別包含 FLAG 標記蛋白的細胞組分。
26. 加入 0.4 ml 抗 FLAG M 2 的單克隆抗體偶聯的小珠至裝有 10～14 ml 核抽提物（或 S100，或溶解了的核丸）的 15 ml 試管，這些小珠預先用 BC100 洗滌幾次。在一個試管旋轉儀中將樣品于 4℃ 孵育 6～12 h。
27. 4℃ 300 g 離心 1 min，將上清和小珠分離。
28. 棄上清，用 BC300/0.1% 諾乃洗滌劑 P-40 洗滌綁定著蛋白質的小珠 5 次。
包含諾乃洗滌劑 P-40 防止蛋白質/小珠聚集，也有助于在洗脫過程中免疫親和小珠更好地旋轉。
29. 轉移帶有綁定蛋白質的 M2 偶聯的小珠至一個微量離心柱中。
30. 最高速度（10000 r/min）離心 10 s 以去除殘留液體。
31. 加 0.5 ml BC300/0.1% 諾乃洗滌劑 P-40 及 0.2 mg/ml FLAG 肽至干燥的小珠。充分混勻，4℃ 連續旋轉孵育 20～60 min。
32. 4℃ 離心 10 s 收集洗脫液（也就是第一次洗脫）。
33. 重復洗脫（步驟 31 和 32）（總共）4 次以得到絕大部分的 FLAG 標記的蛋白復合體。
34. 分裝樣品成小份（如 20 μl） 于 0.5 ml 微量離心管，然后用液氮速凍。將純化了的復合體小份儲存于 -80℃ 直到使用。
注意事項
通常對 HeLa 細胞所使用的藥物濃度依賴于單個藥物篩選標記，分別是：G418（總重）為 1 mg/ml，潮霉素為 0.2 mg/ml 或 0.5 μg/ml 嘌呤霉素。額外細節見轉染哺乳動物細胞選擇實驗。